文档介绍：分子克隆及细胞培养基本实验方法
载体构建实用操作技术
%甘油菌
2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20C或-70 C备用。（甘油菌中甘
油的浓度为20-30%均可）
、培养
方法一、挑取甘油菌一环，接种在含 100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌
种）,37 C培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含 100ug/ml Amp
的LB液体培养基中，37C振荡过夜（约12~16小时）。
方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，
37 T振荡过夜（约 12~16小时）。
小规模制备质粒 DNA （QIA miniprep kit ）
适于从1~5ml菌液中制备20ug高拷贝质粒
⑴收集菌液，离心1000rpm，1分，弃上清
⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase）
⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组 DNA，并免
长时间消化）
⑷加入350ul N3，迅速颠倒 4~6次轻混；离心 10分，13 000rpm
⑸上清入 QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之
⑹ PB洗，离心 30~60秒
⑺ PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心 1分
⑻换新管，加入 50ul EB，静置1分（EB 37 C预热），离心1分。
⑴体系构成（反应体系尽可能小！）
pGEM3ZF-huCTLA4-Ig (ul) pAdTrack-CMV (ul)
17
17
3
3
5
1
1
10X NEbuff 2 3
10X BSA 3
底物DNA 5
内切酶 Hi nd川 1
Xba I 1
Total : 30 ul 30ul
⑵37C水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至 12小时
⑶酶切2小时后，取5-10ul电泳观察酶解是否完全
⑷65 C灭活内切酶
⑸-20 C保存备用
回收目的片段(QIAquick Gel extraction Protocol )
⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重；
⑵加入适量buff QG (300ul QG /100mg胶)；＞2%的胶，应加大 QG用量(600ul QG /100mg )；
⑶水浴50 C, 10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与 buff QG相似；
⑷当DN***段在＜500bp或＞4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DN***段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量；
⑸ 结合：将混合物转入 QIAquick柱，离心13000rpm，1min ；(柱容量 800ul/次)； ⑹洗： buff PE，离心13000rpm，1min ； ( DNA用于盐敏感操作时，如平
端连接、直接测序，加入 PE后静置2-5min )；弃离心液，再离心 13000rpm，
1min，以去除剩余的乙醇；
⑺将QIAquick柱置于一清洁的 Ep管，加入 30~50ul buff EB 或 出0 (滴 于 QIAquick 膜上！)，静置 1min，离心 15000rpm， 1min ；
⑻-20 C保存备用。
反应组份 数量（ul）
8
T4 10X buff 2
载体DNA（ ul） 1
目的片段（ul） 8
T4DNA连接酶 1
Total : 20 ul
⑵16C水浴12-16小时（过夜）
⑶直接用于转化或-20 C保存备用
⑴ 菌种10-20ul入5ml LB液体培养基（不加 Amp）, 37C振摇4-6 hr，至中对数 期；
⑵菌液冰浴10min，分装2管，离心（4 C, 4 000-6 000rpm ）收菌；
⑶弃上清，将菌体悬浮于 800ul CaCb （冰预冷）中，冰浴 10min，离心
（4C，4000-6000rpm ）;
⑷ 再将菌体悬浮于 200ul CaCb （冰预冷）中，冰浴， 12-24hr可用。菌体 沉淀时，重悬操作要轻。
⑴新鲜感受态细胞 200ul，加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min ; ⑵42C热休克90sec,勿摇动试管，再冰浴 2min ；
⑶加入液体LB培养基（无抗生素） 800ul，37 C温和振摇45-60min ;
⑷离心 4