文档介绍：分子克隆
一、模板获得
简介：我们做分子克隆常用的模板有两种，以下我们将分别介绍其提取方法。
（一）、g DNA（其提取方法可分为两种：SDS法和CTAB法）
1、SDS法（干种子、叶子、根都适用此法，可根据实验适当调节用量，叶子一般50-200mg）
（1）、干种子一粒，研成粉末，；
（2）、加入800uL SDS提取缓冲液，65°C水浴（10-20min），剧振，然后4°C、12000rpm离心10min,取上清于新离心管中；
（3）、加入等体积预冷的Tris饱和酚/***仿/异戊醇（25：24：1）混匀几次（用力适度），4°C、12000rpm离心10min，取上清于新离心管中；
（4）、加入等体积预冷的***仿/异戊醇（24：1）混匀，4°C 12000rpm离心10min，吸上清至新离心管（此步骤再重复一遍）；
（5）、向上清中加入10%的醋酸钠（3mol/L），再加入2-，轻轻颠倒几次，－20°C沉淀30min，后4°C、10000rpm离心8min，弃上清；
（6）、用500uL 70%的乙醇清洗DNA沉淀，4°C、8000rpm离心5min；
（7）、重复上一步；
（8）、沉淀放超净工作台中干燥；
（9）、加入50uL灭菌的ddH2O，4°C溶解12h；
（10）、1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，—20°C保存。
注：
①、水浴期间，应每隔5min剧烈振荡一次；
②、在使用离心机前应先预冷；
③、饱和酚/***仿/异戊醇混合液和***仿/异戊醇混合液应现配现用；
④、本实验中使用的乙醇应提前存放于—20°C冰箱中；
⑤、，则乙醇浓度为70%；若加2倍体积的乙醇，则乙醇浓度为65%；
⑥、若对DNA浓度要求比较高，应该在DNA溶于水后加入RNaseA（原液浓度为10mg/ml），建议工作浓度为1-100ug/ml；当用100ug/ml时，1ml样品中加10ul，当用20ug/ml时，1ml样品中加2ul。
2、CTAB法
（1）、取新鲜叶片3-5g，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末，然后将粉末放到50ml离心管中，加入65℃预热的CTAB提取缓冲液（见附录），迅速混匀；
（2）、将离心管置于65℃水浴中温育1h，期间温和混匀数次；
（3）、取出离心管，加入等体积的酚/***仿/异戊醇（25：24：1）溶液，混匀后12000rpm离心20min；
（4）、加入等体积的***仿/异戊醇（24：1）溶液，混匀后12000rpm离心20min；
（5）、离心后将上清液移入另一离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，轻轻混匀，—20℃静置30min，缠出DNA，75%乙醇清洗两次，室温干燥后溶于5ml 1xTEbuffer（）中；
（6）、加入10ulRNaseA溶液（10mg/ml），混匀，37℃保温2h；
（7）、加入等体积的酚/***仿/异戊醇溶液，轻轻混匀后，12000rpm离心20min，取上清液，再加入等体积的***仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀后，12000rpm离心20min；
（8）、取上清液，加入1/10体积3M醋酸钠溶液（），混匀后再加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，—20℃静置30min，缠出DN