文档介绍：一)实验原理双缩脲( NH 3CONHCONH 3)是两个分子脲经 180 ℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与 CuSO 4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键, 这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有: 硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。(二)试剂与器材 : (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA )或标准酪蛋白,配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液,可用 BSA 浓度 1mg/ml 的A280 来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H 2O或 %NaCl 配制,酪蛋白用 NaOH 配制。(2)双缩脲试剂:称以克硫酸铜(CuSO 4?5H 2O)和克酒石酸钾钠(KNaC 4H 4O 6?4H 2O),用500 毫升水溶解,在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH 溶液, 用水稀释到 1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 : 可见光分光光度计、大试管 15支、旋涡混合器等。(三)操作方法 :取12支试管分两组,分别加入 0, , , , , 毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到 1毫升,然后加入 4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25 ℃)下放置 30分钟,于540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定:取 2~3 个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml 。三、 Folin —酚试剂法( Lowry 法) (一)实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂, 即 Folin —酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin —酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。 Folin —酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多, 缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反