文档介绍：52
?分子克隆技术?
实验操作手册
李香花吴昌银邢永忠
华中农业大学生命科学技术学院
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课程简介
分子克隆技术是指DNA RNA操作试剂 39
Stock Solution: 39
Work Solution 40
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系列一分子克隆技术
实验一质粒的制备
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的别离与提取是最常用、最根本的实验技术。
质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的别离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
实验材料：含有质粒pUC18〔或pUC19〕载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。
实验原理：在pH ~ ，细菌大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大局部染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大局部细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、***仿抽提进一步纯化质粒DNA。
实验步骤：
取含有pUC18〔或pUC19〕质粒或含有BAC的大肠杆菌菌液分别于含氨苄青霉素或***霉素的LA培养基上划线别离单菌落，37℃培养过夜；
用接种环或无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，置于转速~250 r/min的摇床上，37ºC培养过夜；
ml菌液，12000 rpm离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液， ml菌液于同一离心管内，再次离心收集菌体，将菌液尽量倒干净；
参加300 ml溶液 I，重新悬浮细胞，振荡器上混匀〔注意：应彻底打匀菌体沉淀〕；
参加300 ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；
参加300 ml溶液III，颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；
12000 rpm离心10分钟；
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吸取800 ml上清液〔注意：不要吸取到飘浮的杂质〕离心管中，参加2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；
12000 grpm 常温离心10分钟；
倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐〔放置片刻或离心3分钟后倒去上清〕；
室温放置或超净台上风干DNA；
加40 ml灭菌超纯水或TE溶解；
质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。
附注：质粒检测
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型
吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，假设吸光值260nm/－，说明质粒质量较好，，低了说明有蛋白质污染，高了说明有RNA污染。

实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中别离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为别离和鉴定核酸的常用方法。
实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学****琼脂糖凝胶电泳的操作。
实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。
实验原理：~，核酸分***基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而到达别离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料〔如EB〕后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
实验步骤：
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用胶带将洗净、枯燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；
调整好梳子的高度；
g琼脂糖于30 ml ×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50ºC时倒入制胶板中；
凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；
将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；
pUC18： 5µl DNA + 3µl ddH2O + 2µl溴酚蓝共10µ tube中混合后点样；
BAC：10µl＋2µ tube中混合后点样
注意：记录不同样品的泳道位置
将制胶板放入电泳槽中，参