文档介绍：病理学进展
浙江中医药大学附属一院
倪桂宝病理学概念:病理学是研究疾病病因、发病机制、形态结构改变以及由此而引起的功能变化的一门基础医学与临床医学之间的桥梁学科。基础病理学、实验病理学和临床病理学（诊断病理学），自1858年Vircho
10%中性甲醛（浓甲醛10ml,）
4%（多聚甲醛40g,
500ml,两者混合加热至60°C,搅拌并滴加INNaOH至清晰为主，冷却后加PBS至总量1000ml）。
（2）组织固定注意事项
手术离体标本，应尽快固定；
；
固定液的量：体积一般大于组织的20倍；
固定时间：一般8~24小时内；
组织固定后应充分水洗。
石蜡切片要求
组织脱水、浸蜡和包埋：温度不超过60°C。
组织切片：厚在4〜5卩左右，在45C温水中展片，60C温箱拷片
3-8小时。
载玻片防脱片处理：%多聚赖氨酸水溶液。
2、抗原修复
热处理：高压锅、水浴锅、微波炉等。
酶消化：%胰蛋白酶、%胃蛋白酶。
消除内源性过氧化物酶：%过氧化氢甲醇液。
3、抗体的稀释度：根据抗体原液的说明如：1：501：1001：
500等。
4、孵育时间(4C过夜或37C1小时)。
5、显色剂：DAB(3，3二氨基苯联***)或AEC。
6、封固剂：加拿大中性树胶。
7、实验对照的设计：空白对照、替代对照、阳性对照、阴性对照、自身对照。
8、结果的判断：有多种计数方法，如计数100-1000个细胞，阳性细
胞V10%(-)；10〜25%(+)；26~75(++)；>75%(+++)。
9、冰冻切片制备
洁净玻片经95%洒精处理后，空气中自然干燥；
切片厚4-8卩；
（3）自然干燥，不超过30分钟；
（4）冷***（4°C冰箱中备用）固定10分钟；
（5）PBS洗3次,接免疫组化。
各种方法的评价A、不同酶标记敏感性比较B、常用免疫组织
化学敏感性比较
几种主要免疫组织化学技术操作方法：
包括免疫酶组织化学技术，免疫荧光组织化学技术，免疫金银技术，免疫电镜技术等。
（一）免疫酶组织化学技术
1、链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连结法（S-P）：S-P法是采用生物素标记的第二抗体与链霉抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。
操作流程：
（1）石蜡切片脱蜡的水化后，用PBS（）洗3X3min。根据一抗的要求进行抗原修复。
（2）每张切片加1滴或50UL过氧化物酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温10min。
（3）PBS洗3X3min。
（4）滴加50UL的非免疫性动物血清，室温10min。
（5）甩去血清，滴加50UL适当稀释的一抗，室温下孵室60min或
4C过夜。
（6）PBS洗3X3min。
滴加50ML生物素标记的二抗，室温孵育10min。
PBS洗3X3min。
滴加50ML链亲和素过氧化物酶溶液，室温孵育10min。
PBS洗3X3min。
(11)DAB或AEC显色。
(12)流水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。
2、EnVison法在抗原抗体发生结合后，第二抗体上标记有多聚物酶复合物与第一抗体结合，因二抗上的多聚物可结合许多的HRP分子。敏感性较PAP、
ABC、S-P等方法高出几十倍，背景清晰，无非特异性干扰。操作流程：
石蜡切片脱蜡的水化后，用PBS()洗3X3min。根据一抗的要求进行抗原修复。
每张切片加1滴或50ML过氧化物酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温10min。
(3)PBS洗3X3min。
滴加50ML的非免疫性动物血清，室温10min。
甩去血清，滴加50ML适当稀释的一抗，室温下孵室60min或
4°C过夜。
(5)PBS洗3X3min。
滴加50ML多聚物标记的二抗，室温孵育30min。
(7)PBS洗3X3min。
(8)DAB或AEC显色。
(9)流水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。
(二)免疫荧光组织化学技术免疫荧光技术是通过荧光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察荧光的发光物质。用于检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。
1、直接法：是以荧光标记抗体直接与标本内的抗原反应，根据荧
光的分布位置及强度而确定抗原的种类、性质、存在部位与形态学的关系。
操作流程：
冰冻切片经***固定10-20min,PBS充分洗；石蜡切片经常规
脱蜡至水，%胰蛋白酶消化40min,PBS洗3X3min。
适当稀释荧光抗体37°C温育50min。
PBS洗3X