文档介绍：分子克隆实验设计
一、总体实验流程
二、实验内容
（一）PCR （聚合酶链式反应）
：
利用DNA在体外摄氏95度时解旋,45-60度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合, 再调温度至72度左右，DNA聚合酶沿g 离心 30-60 秒，弃去接液管中的液体。
向Spin column中加入650 u l Wash buffer， 12000g离心30-60秒，弃去接液管中的液体。
重复步骤7 一次。
再次将Spin column离心 1分钟后，小心去除残留的液体，心管中。
加入50 ul的Elution Buffer，室温静止1分钟，12000g离心1分钟回收DNA样品。
（四）连接T载体
1. 反应体系
Component
Volume
Vector pTZ57RJT, ( pmol ends)
3 pl
5X Ligation Buffer
6 pl
PCR product ( pmol ends)
variable*
Water, nuclease-free
to 29 pl
T4 DNA Ligase
r ipi
Total volume
30 pl
将连接混合物在室温（22°C）孵育1h。如果转化需要达到最大值，4°C孵育过夜。
。
（五）转化
取感受态细胞至于冰浴中融化。
向感受态细胞悬液中加入5ul连接产物，轻轻旋转离心管混匀，冰浴30min。
将离心管置于42度水浴中60-90s，然后快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却2-3min, 该过程不要摇动离心管。
向离心管中加入600ul无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37度摇床上震荡培养45min,使菌体复苏。
分别吸取100ul和300ul，均匀涂布于LB固体培养基上（含抗生素），将平板置于室温直至液体被完全吸收，之后转移至37度，倒置培养12-16h。
（六）挑菌与摇菌
1•使用黄色200ul枪头，挑取单个形态良好的克隆，直接连同枪头打入5ml LB培养基中。每支LB培养基只能打入一个单克隆。
加入 50ul Amp。
封好管口，固定放置在37度摇床，振摇12-16h。
（七）质粒提取（天根生化公司质粒小量提取试剂盒）
柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL, 12,000 rpm（~13,400Xg ）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm（~13,400X g ）离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
向留有菌体沉淀的离心管中加入250 “溶液P1 （请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
向离心管中加入250 Ul溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DN***断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，