文档介绍：高级生物与分子生物学
实验报告
姓名：学号：
指导老师
实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达
【实验原理】：
DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，0：

30%丙烯酷胺’

tOMTris-CI()：

10%SDS：
OJml
10%过硫酸镀：

TEMED：

②样品制备
dH20；

30%丙烯酰胺主

1MTris-CI():

10%SDS：
!
忆％过硫酸饕
!
TEMED：

莹液
|离心，4000^171,5分钟
弃上清再120Croni瞬时養心
I
用枪吸去上清’加
50uI重悬沉淀
［加入50ul2xSDS样品缓冲液
混匀后至沸水浴中煮45分钟
4度或-20度保存
加样
电泳(200V)
染色：考马斯亮蓝染色或银染
【实验结果】
重组质粒的鉴定
空双单质M双单质
【实验分析】
⑴在重组质粒酶切鉴定图谱中，第一加样泳道为DNAmarker,接下来的三泳道依次为：没有经过酶切的重组质粒加样泳道，双酶切的重组质粒加样泳道，单酶切的重组质粒加样泳道。经过分析，经单酶切的重组质粒两片段的分子量大小分别符合载体pET28a(+)和目的基因X的大小，即重组质粒构建基本成功。但是，每一泳道都有拖尾，这可能是酶切时间过短，使酶切不彻底，也可能是限制性内切酶活性不高，未放于冰上，使其酶切效果不佳。也有可能是胶制作不理想或者电解液不纯所造成。总之，能引起跑胶拖尾的原因很多，必须每一步都正规操作，尽量防止这种情况的出现。
⑵在不同时间间隔IPTG诱导重组质粒表达蛋白图中，从左边起的第一至第三泳道分别是时间间隔为0h,lh,2h重组质粒经异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)诱导在BL-21细胞中蛋白表达后用考马斯亮蓝染色的图示，可以看出蛋白表达量依次增多。
实验二：脲酶的分离纯化及比活性测定
实验仪器、试剂】：
仪器：
721分光度计
试剂：
1、3%尿素
2、
3、1mol/LHCl
4、32%丙酮溶液
5、纳氏试剂
6、
【实验原理】：蛋白质（酶）是非常重要的生物大分子，其性质差异很大。蛋白质的分离和提纯工作室一项艰巨而又复杂的任务。到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对于任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品
脲酶分子量较大，达490kD。当脲酶粗制品通过交联葡聚糖
SephadexG-200层析柱时，此酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内。而其它小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒，因此，用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。定时或定量收集洗脱液，分别在752分光光度计282nm波长测定其吸光度，再分别测定洗脱峰内各管的酶活性，以酶活性为纵坐标，以管号为横坐标，会出酶活性曲线，酶活性与蛋白质洗脱曲线中峰值重叠的部分即为分离所得到的脲酶所在部位。
酶活性测定系根据酶催化尿素水解释出氨和co2作用。
CO(NH2)^+h2o
•2NHa+CO2
反应2
NH4OH+2(Hgl2-2KI)+3NaOH
v'
奈氏试剂
ZH\
+ONHJ■+4KI+3Nal+3H?O
硫代双隶氨〔黄色)
聯酶活性高主成氨就多*黄色亦深
【实验步骤】
制备脲酶粗提液
称05克黄豆粉于小三角瓶中
I
%丙酮！靂荡10miri
亠I
离心3000转，10分钟
I
上清液转至新离心管，加4倍体积冷丙酮
I
离心3000转，5分钟
I
沉淀，待丙酮挥发了加1靳1蒸谓水溶解
离心3000转，10分钟
I
上清/粗提液
凝胶过滤层析
装柱：保持竖直，防分层、干裂
平衡：装好后用蒸馏水平衡
加样：
洗脱与收集：用蒸馏水洗脱，3ml/15分钟/管，收集12管
蛋白质含量检测
蛋白质活性检测
【实验结果】：

管号
试剂
1
2
3
4
5
6
7
(ml)

-
含NH3的微克分子数