文档介绍：克隆指南
大多数克隆实验包括以下几种操作:
1 将 DNA 片段插入到质粒中,用于下游蛋白表达;将多克隆位点插入质粒中;
2 将抗性基因、启动子和信号序列等加入到质粒中,增加质粒特征(如耐药性)。以下指南有助于克隆的设计和相关问题的解决。
准备插入片段和质粒
来源于质粒的插入片段
选择适当的限制性内切酶切割质粒,获得能直接克隆于载体的 DNA 片段。选择能产生不匹配末端的限制性内切酶来进行单向克隆。
来源于 PCR 的插入片段
引物设计时引入能单向克隆到载体的限制位点
大多数限制性内切酶的识别位点上游需要 6个保护碱基
如需高保真选择具有校读功能的聚合酶,如:Phusion(NEB #F-530)或 Vent(NEB #M0254)DNA 聚合酶
PCR 产物可通过凝胶电泳回收或离心柱纯化
选择用适当的限制性内切酶消化
来源于退火寡核苷酸的插入片段
退火的寡核苷酸用来引入 DNA 片段(如启动子和聚合接头等)
两条带有互补的 5' 和 3' 突出末端寡核苷酸退火后能被连接到用适合的限制性内切酶切割的载体中
未磷酸化的寡核苷酸用 T4 PNK(NEB #M0201)磷酸化
载体
选择适当的限制性内切酶消化载体,最好使用能产生不匹配末端的内切酶,以防载体自接。
去磷酸化
去磷酸化反应是用来防止自身连接。两种 DNA 去磷酸化的产品。
-小牛肠碱性磷酸酶(CIP)是一种活力较强的去磷酸化酶,在许多不同条件下及各种 NEBuffer 中均有活性。然而,CIP 不能被热失活,因此需要在连接前纯化DNA。建议 CIP 的使用量不要超过推荐用量,以达到更好的纯化效果。
-热敏磷酸酶(AP)不仅具备CIP 的所有功能而且还能被热失活。AP 需要锌离子发挥活性,添加锌离子后,AP 在 4 种 NEBuffer 中均能发挥正常活性。
平末端
有些时候实验需要插入的片段和载体为平末端
用具有校读活性的聚合酶进行 PCR,其产物的绝大部分是平末端
T4 DNA 聚合酶或 Klenow能补平 5' 突出末端(如 EcoRI),切割 3' 突出末端(如 PstI) 快速末端平齐试剂盒能在 30分钟内完成 DNA 末端的平齐化和磷酸化
磷酸化
连接两个 DNA 片段时