文档介绍：醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白
【实验目的】
【实验原理】
蛋白质是***电解质。在pH值小于其等电点的溶液中,蛋白质为正离子,在电场中向阴极移动;在pH值大于其等电点的溶液中,蛋白质为负离子,在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质,它们所具有的可解离基团不同,在同一pH的溶液中,所带净电荷不同,故可利用电泳法将它们分离。
血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等,各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同,在电场中迁移速度不同。由表可知,,,它们都电离成负离子,在电场中向阳极移动。
表1 人血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量
在一定范围内,蛋白质的含量与结合的染料量成正比,故可将蛋白质区带剪下, NaOH溶液浸洗下来,进行比色,测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描,测定其相对含量。
肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高,γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低,而α1、γ-球蛋白升高。
【实验器材及试剂】
器材:醋酸纤维薄膜,人血清或牛血清,烧杯,培养皿,镊子,载玻片,盖玻片,电吹风,电泳槽,直流稳压电泳仪,剪刀,手套,滤纸;
试剂:巴比妥-巴比妥钠缓冲液(,)
染色液(可重复使用,使用后回收)
漂洗液(100ml每组):95%乙醇45ml,冰乙酸5ml,水50ml
透明液(20ml每组):无水乙醇14ml+冰乙酸4ml,混匀
【操作方法】
1. 薄膜浸泡:将醋酸纤维薄膜在缓冲液中浸透(30min),取出后用滤纸吸去多余缓冲液。
2. 调整电泳槽水平,加电极液,搭建滤纸桥。
3. 点样:用盖玻片蘸取少许血清,~2㎝处接触。血清投入后移去载玻片,将薄膜平贴于已放在电泳槽上并已浸透缓冲液的电桥上,点样端为阴极。
4. 电泳:先平衡10min,后90V预电泳10min,再调电压110V,电泳50min~1h左右,结束。(点样带不要接触滤纸条)
5. 染色:电泳完毕,将薄膜浸于染色液中5~10min。
6. 漂洗:取出薄膜,用漂洗液漂至背景无色(约4~5次)。
7. 透明:将薄膜平贴于干净的玻璃器皿壁上,用配制好的透明液滴在薄膜上,薄膜逐渐透明,待其完全透明后,用吹风机将薄膜吹干,然后小心将透明条带揭下。
【实验结果】
电泳结果:
【注意事项】
1. 取出薄膜吸取上面多余的缓冲液溶液时,注意不要长时间放置于滤纸上,防止渗于薄膜内的缓冲液被洗出来,而导致电泳时蛋白质不能完全分开,影响最后结果。
2. 在往电解槽中加入电极液时要注意电极液高度不能超过红色划线,且电极槽液面要保持一致,同时要漫过电桥,否则无法形成回路,不能进行电泳。
3. 连接电泳仪线路时要注意正负极,用前检查电泳仪是否可用,在打开电源之前一定要把电压旋钮调至零,否则一打开电源,瞬间电压过高会烧坏仪器。
4. 在把薄膜放到电桥上时,要注意点样区不能接触到电桥上的滤纸,且点样区放在阴极端