文档介绍：分子克隆实验原理
分子克隆实验原理
一、菌种保存和活化
二、质粒提取和保存
三、感受态细胞的制备
四、载体的制备
五、基因的制备
六、连接
七、转化
八、重组克隆的筛选
菌种保存和活化
:
1、 100 ul菌液+100 ul灭菌甘油【混匀】
2、多制备几管,做上标记【菌名,质粒,时间】
3、-20 ℃可保存半年;【-80 ℃可长期保存】
二、甘油菌活化:
1、取一管甘油菌,混匀;
2、用接种针接种并在培养平板上划线;
3、37 ℃倒置培养12 h;
4、 LB (视情况加抗生素),37 ℃振荡培养12 h.
【注明:甘油菌用完后,最好扔掉,反复冻融易死亡。】
质粒的提取原理-碱裂解法
三种溶液:
溶液1: 50 m mol/l 葡萄糖----------------维持渗透压,防止DNA受机械损伤降解;
25 m mol/l Tri· Cl (pH )---维持 pH;
10 m mol/l EDTA (pH )------螯合Ca2+, DNase 失活,保护DNA
溶液2: mol/ NaOH--------------------核酸变性(pH>12或pH<3) (解链)
1% SDS-----------------------------蛋白变性,裂解细胞。
溶液3: mol/L NH4AC (pH ) -------沉淀蛋白,大分子核酸,调节pH,使小分子核酸复性(可溶)。
其它溶液:
(1)2M NH4AC------------------------------沉淀蛋白,溶解核酸;
(2) 异丙醇-----------------------------沉淀质粒
(3)70%乙醇---------------------------沉淀质粒,除去异丙醇,盐分。
(4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
质粒的提取原理-碱裂解法
Protocal:
ml 菌液, 12000 rpm * 1 min, 弃上清(repeat) --收集细菌
溶液1 (200 ul), 剧烈混匀-------------提供缓冲液
溶液2 (400 ul),温柔混匀,冰中5 min;-------裂解细胞,蛋白核酸变性
溶液3 (300 ul), 温柔混匀,冰中10 min;-------质粒复性
13000 rpm* 5 min, 取上清;------------除去细菌蛋白,基因DNA
540 ul 异丙醇, 室温 10 min;------------沉淀质粒
14000 rpm * 10 min, 弃上清;------------除去可溶性杂质
100 ul 2M NH4AC
13000 rpm* 5 min, 取上清;
100 ul 异丙醇,室温10 min;
14000 rpm * 10 min, 弃上清;
70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清;-----除去异丙醇,盐分
烘干10-30 min, ----------------- 除去乙醇
50 ul ddH2O ( mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.----除去细菌RNA
电泳鉴定
初
抽
精
抽
除去少量杂质蛋白
质粒的保存
(可含EDTA) 中可短期保存
[4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
2. 75%乙醇可长期保存.
3. 烘干可长期保存(可能难溶)
载体的制备
1、酶切(放大体积100 ul,要充分)
2、胶回收(注意远紫外照射时间不能太长,防止DNA突变)
3、纯度,浓度测定。(电泳测定)
基因的制备(*)
1、PCR扩增
2. 酶切
3、胶回收
4、纯度,浓度测定