文档介绍：猪卵泡颗粒细胞凋亡的检测及影响因素
报告内容
一引言
二颗粒细胞凋亡的研究
三颗粒细胞凋亡的生物学特征
四颗粒细胞凋亡的检测
五颗粒细胞凋亡的调节机制
六颗粒细胞凋亡的影响因素
七研究意义
一引言
哺乳动物卵泡闭锁十分普遍,只有少量卵泡发育成熟排卵,其余大部分卵泡都将闭锁退化。在卵泡由原始卵泡向初级卵泡、次级卵泡逐渐发育成排卵前成熟卵泡时,卵泡闭锁同时发生
目前认为颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的主要原因,并先后在大鼠(1991)、猪(1998)、牛(1994)和绵羊(1995)等身上得到证实
二卵泡颗粒细胞凋亡的研究
细胞凋亡(Apoptosis) 是一种由基因控制的细胞自主性的程序性死亡(PCD) 过程
1885年就有人描述了兔卵巢细胞凋亡形态变化
1989年有人在小鼠颗粒细胞和黄体细胞中检测到对染色质的核小体具有酶切作用的核酸内切酶活性
1991年,Jonathan 等对鸡、猪的卵泡研究, 验证了凋亡细胞的存在, 同时建立DNA 梯度电泳分析的方法
1991年Tilly在鸡上证明颗粒细胞凋亡现象存在于卵泡闭锁过程中,并且提出卵泡闭锁的实质很可能就是颗粒细胞的凋亡
1994年,Angelia 等用标记法对大鼠卵巢中的凋亡细胞进行了检测和定位
三颗粒细胞凋亡的生物学特征
正常颗粒细胞(图1)
凋亡早期
颗粒细胞中出现染色质凝缩,向核边缘聚集,核电子密度增大,核膜皱缩,但胞质中细胞器尚维持较正常状态(图2)
凋亡中期
染色质进一步高度凝集和边缘化,并靠近核膜,形成凋亡细胞常见的典型的半月结构。胞质中出现较多的空泡(图 3)
凋亡后期
细胞碎裂后形成凋亡小体。它们是由部分高度凝集的染色质被质膜包裹所形成的一种凋亡细胞残体(图 4)
四颗粒细胞凋亡的检测方法
方法
形态学
生化
流式细胞仪
光学显微镜
荧光显微镜
透射电镜
TUNEL
DNA Ladder
ELLSA
Annexin
光学显微镜观察
HE染色法
石蜡切片:取材→固定→上行梯度酒精脱水→二甲苯→透蜡→包埋→切片→贴片→染色
颗粒细胞涂片:颗粒细胞悬液→预固定→涂片→风干→固定→染色
方便,快速,成本低,是检测大量样本的较好选择
荧光显微镜观察
常用的DNA特异性染料有Hoechst 33342,Hoechst33258,DAPI,这些染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发出明亮的蓝色荧光
这种方法也方便快捷,可以在第一时间观察,也是检测大量样本的较好选择
透射电镜观察
制作超薄切片,利用透射电镜观察细胞核和细胞质的微观变化
可根据颗粒细胞凋亡各个时期的生物学特征来详细区分凋亡所处阶段,检测结果准确,但操作程序复杂,且需要昂贵的透射电子显微镜
DNA末端原位标记(TUNEL)法
脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-lableling TUNEL)
原理:颗粒细胞凋亡时,染色体DNA双链或单链断裂而产生大量的3′-OH粘性末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素,过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3′-末端,从而进行凋亡细胞的检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3′-OH形成,很少被染色
TUNEL可进行原位染色,能准确反映细胞凋亡的典型生化特征和形态学特征,可用于石蜡切片,冰冻切片,培养的细胞和组织分离的细胞的形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用