白菜类作物叶片长宽性状QTL定位分析.docx

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邓 杰 王 辉 程 锋 武 剑 王晓武
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室，中-荷联合园艺作物基因组技术实验室，北京 100081）
白菜类蔬菜是十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）芸薹种（.）中的栽培亚种群。它包含白菜亚种〔（L.）Makino〕、大白菜亚种〔（Lour）Olsson〕、芜菁亚种（）。随着栽培历史的发展，在这些亚种中又有变种、类型及其品种的逐渐分化，已成为我国栽培蔬菜中庞大的亚种、变种及其品种的群体。
叶部是白菜类作物的主要食用部位，也是影响其产量和品质的重要指标之一。对白菜类作物叶片性状的深入研究对提高其产量和选择不同叶片表型的育种材料具有重要的意义。目前，对白菜类作物的QTL 研究主要集中在抗病性（Matsumoto et al.，1998；卢钢 等，2002）、抗逆性和抽薹开花（Axelsson
et al.，2001；Kole et al.，2002；于拴仓 等，2004）等方面，专门针对叶部形态学进行QTL 定位的研究工作还较少。本试验利用两个白菜类作物DH 群体和已构建的遗传连锁图谱，针对叶长、叶宽及叶片形态指数性状进行QTL 定位和分析，这将为白菜类作物分子标记辅助育种起到积极的推动作用。
1 材料与方法
DH 群体和遗传连锁图谱
本试验使用2 个DH 亲本Z16〔大白菜，Brassica （Lour）Olsson〕和L143（白菜型油菜，Brassica sarsonPrain）及1 个多代自交亲本苏州青〔普通白菜，（L.）Makino et Lee〕构建了2 个各含有120 个株系的DH 群体：Z16_L143 BC2DH 和Z16_SZQ F1DH。用于构建群体的亲本间在叶片形态方面存在显著差异。利用已构建的上述2 个群体分别具有143、230 个InDel 标记的遗传连锁图谱对叶片形态学性状进行QTL 分析。
群体种植和性状调查
由于供试群体存在易抽薹的现象，将Z16_SZQ F1DH 群体于2011年5月播种于纱棚中，Z16_L143 BC2DH 群体于2011年10月播种于温室中，上述试验均在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。群体内每株系3 次重复，常规栽培管理。播种后约60 d 在株系抽薹开花之前选取自外层起第5 片或第6 片完整无缺损
的叶片，进行拍照并扫描，利用+LA-S 全能型植物图像分析系统测量叶长（LL）、叶宽（LW），计算叶片形态指数（LW/LL）。性状测量的具体标准参照李威等（2009）的方法。
数据统计和QTL 分析
基于本实验室已构建的两个DH 群体的分子遗传图谱，用MAPQTL 软件进行叶片形态学性状的QTL 分析。形态学性状数据以3 次重复的平均值进行QTL 分析。首先利用置换测验做1 000 次重复，估算基因组范围内α= 水平上的LOD 阈值。在本试验中，根据每个性状每条连锁群Permutation test 检测到的95%置信区间的LOD 值作为阈值。利用区间作图法（IM）进行QTL 分析，在每条染色体上每隔1 cM 对QTL 存在的可能性扫描1 次。对于IM 分析检测到的QTL，将最高LOD 值所在位置的标记或与其紧密连锁的标记作为协同因子，对IM 检测到的QTL 进行多座位QTL 模型（MQM）检测。以连锁群上LOD 值最高的位置作为QTL 的位置（van Ooijen，1992）。
白菜类作物自然群体中候选基因表达量与叶片形态指数关联分析
利用包括大白菜、普通白菜、芜菁、乌塌菜、菜薹等95 份不同材料组成的白菜类作物自然群体（表1），提取植株5～6 片真叶时期莲座叶叶片的总RNA，进行转录组测序。该数据用于分析植株莲座期可能候选基因表达量与叶片形态指数之间的相关性。
表1 白菜类作物自然群体中表达谱测序的95 份材料
候选基因序列分析
BrXTH9基因序列来源于大白菜基因组计划公布的全基因组序列及白菜注释基因数据库（/），信号肽剪接位点的预测通过SignalP 软件完成（Nielsen et al.，1997）。文中引用的其他物种XTH家族基因均来源于NCBI（），序列比对通过Clustal W 软件完成（Altschul et al.，1990）。
2 结果与分析
亲本间叶部形态学性状的差异以及在DH 群体中的变异
由图1 可知，亲本Z16 叶片形态指数（LW/LL）较大，表现为较为宽扁的表型（图1-A）；SZQ及L143 叶片形态指数较小，表现为较为细长的叶片表型（图1-B、C），亲本之间存在着显著差异。在Z16_SZQ F1DH 及Z16_L143 BC2DH 群体中，叶片形态指数性状分离明显（图1-D～O）。
由表2、3 可知，构建DH 群体的亲本之间叶柄长、叶片长及叶片形态指数性状经过t检测，存在显著的差异。因而用该群体检测可能获得控制叶片相关性状的QTL。
图1 亲本叶片形态指数表型及在DH 群体中的分离情况
表2 Z16_L143 BC2 DH 群体亲本叶部形态学性状及在DH 群体中的分布
表3 Z16_SZQ F1 DH 群体亲本叶部形态学性状及在DH 群体中的分布
叶部形态学性状的QTL 定位及基因效应分析
利用已构建的分子遗传图谱，采用多座位QTL 模型对白菜类作物叶部形态学性状进行QTL分析。两个DH 群体中，在6 个连锁群上共检测到9 个QTLs 位点。其中6 个QTLs 与叶长相关，2 个QTLs 与叶片形态指数相关，1 个QTL 与叶宽相关。这些QTLs 分别位于A01、A03、A05、A06、A09 和A10 上（表4，图2、3）。
控制叶长的QTL 在Z16_SZQ F1DH 群体中共检测到3 个，分别命名为LL-1、LL-2 和LL-3，分别位于A01、A06 与A09 连锁群上。3 个QTLs %～%之间，其中LL-3 的遗传贡献率最小，LL-1 为减效位点，LL-2 和LL-3 为增效位点（表4）。这3 个QTLs %。
表4 叶部形态学性状的QTL定位及其基因效应
图2 叶部形态学性状QTL在Z16_SZQ F1 DH 群体分子遗传图上的分布
图3 叶部形态学性状QTL在Z16_L143 BC2 DH 群体分子遗传图上的分布
同时在Z16_L143 BC2DH 群体中也检测到3 个控制叶长的QTLs，分别命名为LL-4、LL-5 和LL-6，分别位于A03、A09 与A10 连锁群上。这3 个QTLs %～%之间，且全部是增效位点，%（表4）。两个群体中都在 A09 连锁群上检测到 1 个控制叶长的QTL：LL-3 与LL-5。将这2 个QTLs 两侧标记引物序列分别与大白菜基因组序列（/）比对，结果表明BrID10549 和BrID10541 的位置相近且都位于Scaffold000006 上。
图4 叶片形态指数QTL在Z16_SZQ F1 DH 群体A03 连锁群上的分布
控制叶片形态指数（LW/LL）的QTL 在两个群体中分别各检测到1 个，都位于A03 连锁群上。将在Z16_SZQ F1DH 群体中检测到控制叶片形态指数的QTL 命名为LW/LL-1，可解释的遗传贡献率为 %，在 Z16_L143 BC2DH 中检测到控制叶片形态指数的 QTL 命名为LW/LL-2，%。根
据大白菜基因组计划公布的全基因组序列及亲本Z16 与苏州青的重测序结果，设计InDel 标记，在Z16_SZQ F1DH 群体中对检测到的控制叶片形态指数的QTL 区域进行标记加密。结果表明在BrID111431 位点处检测到1 个较为显著的QTL，其LOD ，%的表型变异（图4）。将在标记加密后的Z16_SZQ F1DH 群体及Z16_L143 BC2DH 群体中A03 连锁群上检测到的叶片形态指数相关的QTL 侧翼标记引物序列与大白菜基因组序列比对分析发现，BrID10459 位于Scaffold000001 上5388767 位点处，BrID10155位于Scaffold000005 上1335769 位点处，BrID111431 位于Scaffold000001 上4719555 位点处，表明两个群体中A03 连锁群上检测到的叶片形态指数相关的QTL 位于染色体上相近的位置。
控制叶宽的QTL 只在Z16_L143 BC2DH 群体中检测到1 个，命名为LW-1，位于A05 连锁群上。这个QTL %，为减效位点，效应值为-。
叶片形态指数候选基因分析
对Z16_SZQ F1DH 群体中检测到的叶片形态指数A03 连锁群上QTL 位点处标记BrID111431的带型与叶片形态指数表型性状进行对应分析，结果表明（图5），叶片形态指数最小的10 个株系其带型均为b，表明这些株系在该标记处的等位基因来源于亲本SZQ；而叶片形态指数最大的10 个株系在BrID111431 位点处的带型均为a，表明这些株系在该位点的等位基因均来源于Z16。上述结果表明在标记BrID111431 位点处，来源于Z16 的等位基因会导致叶片形态指数变大，而来源于SZQ 的等位基因会导致叶片形态植株变小。