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重组pDC317.docx

上传人:bai1968104 2017/12/23 文件大小:27 KB

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文档介绍:重组pDC316
编辑。 作者:周泉波,陈汝福,李志花,周嘉嘉,唐启彬,陈积圣  
【摘要】 【圾目的】克隆人的钠/碘同向搌转运体(hNIS)基因可蒿编码序列,并研究其在非甲刂状腺肿瘤细胞内的功能表达。【方法】利用逆转录和聚懑合酶链反应从毒性弥漫性甲÷状腺肿病人的甲状腺组织中(扩增得到NIS的可编码区捂基因,并克隆到T载体,测蕺序后亚克隆到腺病毒载体穿辊梭质粒pDC316载体上削,获得重组真核表达质粒载蛰体pDC316–MCMV伺/hNIS。采用脂质体转曲染的方法,把pDC316恹-MCMV/hNIS重组μ质粒或pDC316空质粒分别导入到胰腺癌细胞株C呦APAN-Ⅱ细胞、PAN曹C-1细胞和卵巢癌细胞株渣SK-OV-3细胞,转染后48h采用RT-PCR缯方法检测转染细胞内的hN痹ISmRNA水平,转染后ね第2、3、4天分别检测肿阖瘤细胞对125I的吸收功钴能。【结果】序列分析结果璐证实克隆片段与文献报道的黯hNIS基因cDNA序列象完全一致。实验组转染后4问8h,在CAPAN-Ⅱ细劬胞、PANC-1细胞及SK-OV-3细胞内均能检踊测到hNISmRNA高水ど平表达,对照组基本无hNISmRNA表达。转染后舟第3天细胞吸碘达到高峰,肚实验组CAPAN-Ⅱ细胞蝴、PANC-1细胞和SK邢-OV-3细胞对125I煮的吸收量分别比对照组高24倍、17倍和13倍。【沥结论】从Graves病人缫的甲状腺组织中克隆的hN
篥IS基因转染肿瘤细胞后,能使肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能,为进一步运用放射シ性核素体内靶向治疗非甲状击腺肿瘤奠定了基础。
【关鹋键词】 人钠/碘同向转运劣体;逆转录聚合酶链反应;云基因转染;碘放射性同位素
钠/碘同向转运体(so告diumiodidesyむmporter,NIS)是主要存在于甲状腺滤泡细啮胞基底膜上的一种跨膜糖蛋白,在细胞对碘的摄取过程甫中起着举足轻重的作用[1锪]。随着对NIS研究的不蔷断深入,通过NIS基因介祉导放射性核素来进行肿瘤的窜基因治疗是目前国内外的研锕究热点之一[2,3],但性在胰腺癌基因治疗中少有报转道[4]。本研究从Graǚves甲亢病人的甲状腺组妒织中克隆出人NIS基因的凝完整编码区序列,并构建P胜dc316-MCMV/h陵NIS重组穿梭质粒载体,蜩以研究NIS基因转染的胰腺癌等非甲状腺肿瘤细胞对斑碘的摄取功能。
1  材料与方法
  材料
Gr盆aves甲亢病人的甲状腺氅组织取自我院乳甲外科。总艏RNA提取试剂Trizo厍lreagent和脂质体lipofectamin雁e2000均为Invit键rogen公司产品,2×堰PfuPCRMaster纲Mix天为时代公司产品,⒋两步法RT-PCR试剂盒腱Takara公司产品。限挫制性内切酶EcoRⅠ、X
锕baⅠ、HindⅢ及T4鹤DNA连接酶购自NEB公肝司。coliDH5α,pЁDC316vector由中山大学肿瘤医院实验室提供,pGEM-Teasy∈载体本试验室保存。胰腺癌煊细胞株CAPAN-2购买雳于中山大学细胞培养室,胰婴腺癌细胞株PANC-1、┬卵巢癌细胞株SK-OV-鸟3由本试验室保存。DME搓M培养基、四季青胎牛血清躁为威佳公司产品。放射性1ⅹ25I、NaI及KClO崎4均由中山大学实验核医学实验室提供。
  NIS玉基因的扩增及与T载体连接
采用Trizol试剂法从禁1例Graves甲亢病人浚的甲状腺组织中抽提总RN伦A后,使用TaKaRa公承司反转录试剂盒把RNA反轰转录成cDNA,具体方法嘣参考试剂盒说明书。根据重叠PCR方法设计4条引物£以扩增hNIScDNA全抨长1932bp的基因片段:P1:GG洙GGAAC;P2:CAAACATGACGATGC刨CACAGCAGGC;P瓤3:CAGGTCGTGGTGATGCTAAGTG醭GCT;P4:TGCTGGTCT。分别建想立如下3个反应体系:体系1:取甲状腺cDNA1μ擀L,P1、P2(10pm祺ol/L)各5μL,2×鼠PfuPCRMasterMix 25μL,ddH捃2O14μL。体系2:取P3、P4(10pmol御/L)各5μL,其余成份冲同体系1。体系3:把Fr桉agment1和FragГment2的PCR产物稀眶释50倍后混合,取1μL此混合物作为模版,P1、贮P4(10pmol/L)各5μL,其余成份同体系据1。3个体系PCR反应的殡条件一致,如下:94℃预
陋变性2min,94℃变性蝣30s,65℃退火30s旭,72℃延伸3min,共鹩作30个循环,最后于72℃延伸10min,产物放于-20℃冰箱中冻存。体豁系3的PCR产物行1%琼隔脂糖电泳后,胶回收目的片茉段,并与pGEM-