文档介绍：原理
超氧化物歧化酶(SOD)
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一种能专一地清除超氧离子自由基(O2-)的金属酶,它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。
SOD是一种酸性蛋白,对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同,可分为Cu-Zn-SOD(二聚体,蓝绿色)、Mn-SOD(紫红色)和Fe-SOD(黄褐色)三种。
SOD催化下述反应:2H++2O2-→ H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利,SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内O2-的含量相对的平衡。机体内的O2-形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如:呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病(如氩中毒、辐射病等)过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除,会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为 H2O2和O2,而过氧化氢(物)酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解,在机体内形成一套解毒系统,对机体起防护作用。
有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料,从中提取SOD并进行分离纯化。有机溶剂沉淀法的基本原理:①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数,使溶质分子之间的静电引力增加,聚集形成沉淀;②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度,压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度,降低了它的亲水性,导致脱水凝集。常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。
邻苯三酚自氧化法测定酶活力
酶活性测定的方法有以下几种方法:邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定,酶活性单位定义为:每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。邻苯三酚自氧化法的原理:利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化,产生O2-,生成有颜色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色,几分钟后转为黄色,吸光度值与反应时间能在3~4 min内维持线性关系。加入酶液则抑制自氧化的速率,在325 nm波长处测定吸光度值即可。
蛋白质含量测定
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250(Coomassic brilliant blue G-250)在游离状态下呈红色,与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定范围内,溶液在595 nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比,可用比色法测定,测定范围在1~1 000 μg。
SOD同工酶分离鉴定
SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法,核黄素(FAD)经光照所产生的O2-(氧自由基)能使氯化硝基四氮蓝(NBT)有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用,因此,电泳分离SOD后,凝胶上无SOD出应显示为蓝色,而有SOD处则无色透明,由此可鉴定SOD同工酶的酶谱(即同工酶的种类数量、分子量大小分布及活性大小)。
操作步骤
SOD的提取
[1] 取新鲜猪血20ml于50ml离心管,6000r/min,10min离心,去上层血浆,取下层红血球粘稠液,%NaCl溶液清洗,6000r/