文档介绍：471 472 细菌回复突变试验
(Bacterial Reverse Mutation Test)
受试物必备
受试物的化学鉴定
纯度(杂质)
溶解特性
pH(必要时)
稳定性(包括受试物在赋形剂中的稳定性)
熔点/沸点
2 试验目的
细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌需要某种氨基酸的菌株来检测点突变,涉及DNA的一个或几个碱基对的置换,插入或缺失。此试验的原理是检测试验菌株已存在突变的回复,细菌恢复合成必需氨基酸的能力。通过在缺乏受试菌株所需氨基酸的培养基上的生长来检测回复突变的细菌。
点突变是很多人类遗传病的原因,有很多证据表明在人类和试验动物肿瘤形成涉及体细胞癌基因和肿瘤抑制基因的点突变。细菌回复突变试验是快速的、费用较低和较易进行的试验。试验菌株具有一些使其对检测突变更为敏感的特征,如回复突变部位的反应性DNA序列,增强细菌对大分子的通透性,DNA修复系统缺失或DNA易误修复过程增强。试验菌株的特异性可为诱发突变的种类提供某些有用的信息。
定义
回复突变试验(reverse mutation test):利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌检测需要某种氨基酸的菌株(分别为组氨酸或色氨酸)成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变。
碱基置换型致突变物(base pair substitution mutagens):引起DNA中碱基改变的因子。在回复突变试验此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。
移码型致突变物(frameshift mutagens):引起DNA中一个或多个碱基对增加或缺失,故改变RNA的读码框。
测试原理
细菌回复突变试验是利用原核生物(细菌)作指示生物的体外遗传毒理学试验,遗传学终点为基因突变。
(1)在有或无外源性代谢活化系统条件下,细菌悬浮液暴露于受试物。在平板掺入法,细菌悬浮液与顶层琼脂混合,再立即铺至最低培养基上。在预保温法,处理混合物经预保温后,与顶层琼脂混合,再立即铺至最低培养基上。经培养2天或3天后,计数平板上回变菌落数,并与溶剂对照平板比较。
(2)细菌回复突变试验,最常用的是平板掺入法、预保温法、波动法和悬浮法。对气体或蒸气的检测方法也已有报告。
(3)本准则主要叙述平板掺入法和预保温法。此两种方法都可用于有或无代谢活化的试验。有些化合物用预保温法可能更为有效,包括短链脂肪族亚硝胺、二价金属、醛、偶氮染料和重偶氮化合物、pyrollizidine生物碱、烯丙基化合物和硝基化合物。已知某些类别致突变物(如偶氮染料和重偶氮化合物,气体和挥发性化学物和糖苷类),用标准方法如平板掺入法或预保温法并非总能检测出阳性结果,应利用推荐的替代方法来检测。标准方法的改动需要说明理由。
操作方法和程序
准备
(1)细菌的新鲜培养物生长至指数期或稳定期的早期(约109细胞/ml)。在稳定期后期的培养物不应使用。试验中所用的培养物必须含高密度存活菌。存活菌密度可根据细菌生长曲线的历史性对照资料或在每次试验中测定存活细菌密度。
(2)推荐的培养温度为37℃。
(3)推荐的菌株组合为:(a)鼠伤寒沙门氏菌TA1535;(b)鼠伤寒沙门氏菌TA1537或TA97或TA97a;(c)鼠伤寒沙门氏菌TA9