文档介绍：【实验技巧】RIP实验技术
RIP实验技术
导语
近年来,长非编码RNA(lncRNA)得到了研究界的广泛关注。如今,人们已经鉴定了大量lncRNA,但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题,研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究,并为此开发出了越来越多的分析工具。下面我们来介绍一下RIP技术。
RNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIP(RNA immunoprecipitation),可以说是RNA版的ChIP(染色质免疫沉淀),该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。
在RIP试剂盒(如Sigma的Imprint® RNA Immunoprecipitation kit)的帮助下,研究者们能够利用针对RNA结合蛋白的抗体,从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA,再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。
不论是细胞质还是细胞核,都会发生RNA与蛋白的相互作用。据Active Motif公司产品经理Kyle Hondorp介绍,该公司的RNA ChIP-IT® kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作,随后对染色质进行超声,并用DNAse I处理,最后利用磁珠进行沉淀。
“如你研究的是总mRNA,那么常规RIP试剂盒更合适一些,”Hondorp说,“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。”
生产Magna RIP™ RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司,也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布,该产品有化学交联与native两种形式。据介绍,化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用,研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是,亲和力更高也更为直接的相互作用。
除RIP以外,CLIP(UV crosslinking and immunoprecipitation)也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化,不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化(如凝胶电泳片段分离),还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP 技术——iCLIP(individual-nucleotide resolution CLIP),该技术能够以单个碱基的分辨率,来展示RNA-蛋白互作的详细信息。
据伦敦大学学院的Jernej Ule教授介绍,CLIP与RIP的关键性差异,在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记,并将这些复合物进行SDS-PAGE分离,之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性,减少非特异性的RNA。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来,用于制备cDNA文库,以备测序分析。
“CLIP要比RIP麻烦一些,不过我认为它很值得采用,”Ule说。“放射性信号的量及其特异性,能够帮助我们提高cDNA文库的质量,最终得到准确实用的数据。”
一. 细胞裂解液获取
A. 单层细胞或者贴壁细胞处理
1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞