文档介绍：DNA extraction
ZJL
细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子,均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者为双链线性分子;后者为双链环状分子。
除此之外,在原核生物中还有双链环状的质粒DNA;在非细胞型病毒颗粒内,DNA的存在形式多种多样。
DNA extraction
极性化合物,溶于水,不溶于乙醇、***仿等有机溶剂,钠盐比游离核酸易溶于水。
在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。
核酸的理化性质
提取DNA总的原则:
1 保证核酸一级结构的完整性;
2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度;
3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;
4 其他核酸分子,如RNA,也应尽量去除。
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
非基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
断裂成为线状
共价闭合环状结构
基因组DNA的提取
细胞破碎方法
应用
Ⅰ机械法
1匀浆法
机体软组织
2捣碎法
动物韧性组织
3研磨法
细菌、酵母
Ⅱ物理法
1超声法
细胞混悬液
2反复冻融法
培养细胞
3冷热交替法
细菌、病毒
4低渗裂解
红细胞
Ⅲ化学法
1有机溶剂
细菌、酵母
2去垢剂
组织、培养细胞
3酶解法
细菌、酵母
根据裂解方式的不同有:
SDS法流程图(以动物组织为例)
动物组织
细胞裂解
上层溶液
组织匀浆
抽提
干燥溶解
离心洗涤
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA-SDS法
Approximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube;
Add ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC overnight or until tissue is dissolved;
More Proteinase K may be added if digestion is plete after 24 hr;
Add ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT;
Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;
Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;
Add ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT;
Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=) and ml 100% ethanol, invert several times;
A NaOAc solution with pH lower than will cause the EDTA to precipitate;
Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
If there is no pellet, place samples in -80ºC for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4ºC;
Wash pellet once with 70% ethanol, air dry;
Resuspend DNA in ddH2O.
Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.
Phenol-chloroform extraction of mouse tail  DNA