文档介绍：中山大学
硕士学位论文
日本血吸虫病无创型诊断试剂盒开发的前期研究
姓名:周艳萍
申请学位级别:硕士
专业:临床检验诊断学
指导教师:吴忠道
20090605
日本血吸虫病无创型诊断试剂盒开发的前期研究摘要中山大学中山医学院教育部热带病防治重点实验室业:临床检验诊断学硕士研究生:周艳萍师:吴忠道教授专导日本血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,也是我国重点防治的重大疾病之一。血吸虫病的主要危害在于血吸虫虫卵导致的肉芽肿及其组织的纤维化,患者在晚期可出现肝脾肿大、门脉高压和腹水等严重的临床症状,晚期患者会丧失劳动力甚或死亡。因此,血吸虫病及时诊治具有重要的临床意义。血吸虫病诊断常用方法主要有病原学和免疫学方法。由于病原学检查费时耗力,且漏检率高,免疫学方法已成为目前现场查病的主要辅助诊断方法,且主要是以检测血清中特异性抗体的血清学方法,如等。但是在血吸虫病疫区,反复的有创性采血,当地居民的依从性越来越差。而唾液作为诊断样本因其采集简单方便且无创越来越受到关注。已有研究结果提示研发以唾液作为检测样品的无创性诊断试剂盒是可行的。目前用于血吸虫病免疫诊断的抗原主要是血吸虫粗抗原,但粗抗原制备困难,存在一定的交叉反应,且不易标准化,导致检测试剂批间质量不稳定。近年来,随着基因重组技术以及生物信息学的日益发展,可对具有诊断价值抗原的组分及性质进行分析鉴定,再通过重组表达纯化,应用于诊断。为此,我们利用感染者唾液中特异性的魑L秸耄砸压菇ǖ娜毡狙N娉媛裞目饨行了免疫学筛选。应用生物信息学分析技术,对阳性克隆的插入片段进行序列分析,从中挑选具有诊断价值的抗原基因进行克隆表达,并对其免疫学特性以及诊中山大学硕士学位论文
研究目的研究内容和方法反转录合成相应的,采用院蜓”嗦牖蛟诓煌嫫诘南喽员泶断价值进行了初步验证,为进一步研制无创性血吸虫病诊断试剂盒提供实验基获取能被日本血吸虫感染者唾液中特异性抗体所识别的日本血吸虫抗原基因,并完成基因重组表达以及重组蛋白诊断价值评价,为研制能应用于现场的无创型快速筛查诊断试剂盒奠定研发基础。毡狙N娉媛裞目獾拿庖哐秆〖捌溲粜允删宀迦隿蔚男列分析利用日本血吸虫病人唾液筛选日本血吸虫虫卵文库,获得阳性噬菌体,并经两次复筛,选出强阳性克隆作为候选克隆。采用多聚酶链反应际趵┰龀龊蜓∈删宓牟迦肫危擞弥苯硬序技术测定插入片段的核苷酸序列,经编辑后的序列通过库畁畁甮/的,软件进行分析。蜓』虻谋泶镆约懊庖哐匦苑治┰龊钛』蚩7哦谅肟颍寺〉皆靥錺中,并进行诱导表达、纯化重组蛋白后对重组蛋白进行质谱鉴定。以血吸虫感染者的血清和唾液以及非感染者的血清和唾液作为免疫探针,以重组蛋白作为抗原进行用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清作为探针,对重组蛋白和血吸虫不同发育时期的可溶性蛋白进行设计侯选基因的特异性引物,提取日本血吸虫虫卵、尾蚴、成虫的总础。向数据海中山大学硕士学位论文日本血吸虫病无创型诊断试剂盒开发的前期研究向。Ⅱ
研究结果&∞胛删,浣覧反应条件优化及其诊断价值初步鉴定以纯化融合蛋白为抗原,包被酶联免疫反应板,用间接ḿ觳馊毡狙吸虫感染者以及非感染者血清以及唾液。摸索最适抗原包被浓度、最适封闭液和封闭时间、最适血清反应时间、浓度以及反应温度、最适二抗工作浓度、最适显色时间条件。用已优化的觳馓逑狄约癆魑0豢乖匀毡狙N娓腥菊摺非感染者的血清和唾液进行检测,评价其敏感性和特异性。毡狙N娉媛裞目獾拿庖哐秆∫约把粜允删宀迦隿蔚男列分析日本血吸虫虫卵文库的免疫学筛选鉴定以直径为桨搴冀×鍪删叩拿芏冉谐跎福喔龀跎阳性噬菌体。初筛阳性噬菌体再复筛危詈筇羧〕中垦粜允删觥个强阳性噬菌体扩增出特异条带,但其中隼┰銎未笥。取锼腿ゲ庑颍瑿治觯コ馗葱蛄泻螅詈蟮玫条待分析的序列。阳性噬菌体插入片段的序列分析采用蟂和与的械囊阎狣序列和蛋白质序列进行同源性检索。结果发现,在待分析的鮟蛄兄校肫渌镏已知序列同源的序列有酰捶⑾滞葱蛄械挠条,与已知日本血吸虫序列同源的序列有酰渲幸恍蛄蠦治鼋峁允荆频嫉陌被嵝蛄为日本血吸虫毛蚴相关蛋白,其理论分子量约为ǜ没蛟菔泵H本血吸虫毛蚴相关蛋白水平进行分析。中山大学硕士学位论文日本血吸虫病无创型诊断试剂盒开发的前期研究
层析柱纯化的重组表达产物分子大小为势准ǎっ魇验证该目的基因克隆成功。。实验结果显示,沁基因在不同发育期均有转录且转录水平相近。℃封闭.;最适血清反应条件为稀释℃温育幽;酶标二抗①啊Ⅷ抗原性分析以制备的鸠,ⅲ②啷免疫原性分析纯化后的重组蛋白能分别被日本血吸虫感染者唾吗抗原性以及