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中表达,,异麦芽***糖成为主要产物。Zhang等克隆进行定点突变后,发现突变体生成异麦芽***,且突变导致产物中有异麦BL21(DE3)中异源表达,经生物催化后,重组SIase芽糖的形成。研究发现,/L异麦芽***合果糖基的两个重要位点,而突变导致酶对果糖基糖[35]。然而,大肠杆菌由于细胞壁热原和内***的合亲和力下降,容易与酶脱离;与此同时,体系中的葡成,不适用于异麦芽***糖的合成。因此,在安全的食Vol42lssue12023万方数据:..品级宿主中异源表达SIase受到越来越多的关注。是常用菌株之一。(uslactis)由于其非致病性、,有侵染性的特性被认为是重组蛋白质生产和分泌的效解决了异麦芽***糖生产中的食品安全问题[38]。另高效表达菌株惭I。,解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)具有GRASFMB一1的Slase基因在￡./act/sMGl363中异源表认证,是一种公认安全的微生物,,并将所得SIase用于异麦芽***『391。为72%网。同样,枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)也蔗糖异构酶的异源表达见表1。表1蔗糖异构酶的异源表达Table1Heterologousexpressionofsucroseisomerase-)』础e莶幽术墀伯土行。I屯率,%■■臣圜_5U[38][39][40];2鸣[41]、鼍ⅣL^t[42]注:NR代表未报道。提高天然酶的应用性,因此出现了多种蛋白质工程方法(见表2)。目前蔗糖异构酶的分子改造主要集虽然天然蔗糖异构酶可用于异麦芽***糖的生中在提高热稳定性、提高异麦芽***糖的产率以及减物合成,但在工业应用过程中仍存在热稳定性差、少副产物这3个方面。转化率低等问题。[43]E498P/[44]E175N|[45]D398G/.9[46][47]注:3提高率表示突变型酶与野生型酶相比,异麦芽***糖产量增加的百分比。(PalI)与此同时异麦芽***糖的转化率提高了27%f43]。在此在50℃,这严重限制基础上,。。结果发现,定点诱变对其进行分子改造,利用脯氨酸取代将保守序列中的精氨酸或天冬氨酸(Ar9325、Glu498和Ar9310后所得的突变酶,在50℃条件下Ar9328、Asp325和Asp329)突变为中性氨基酸或相的半衰期是天然酶的11倍,显著提高了热稳定性,反电荷的氨基酸时,生成产物中异麦芽***糖占比下台蒜5哇物技东学报2023年第42卷第1期万方数据:..CHENNing,etal:ResearchProgressofSucroseIsomeraseinlsomaltuloseProduction降26%~67%,而海藻***糖的比例增加17%~61%。转化法。,突变点并不影响酶活性,而仅影响蔗糖混合发酵,48h后的产物得率高达90%,然而其产物特异性,由高产量的异麦芽***糖转化为高产由于其发酵环境复杂、成本较高,给后期分离造成量的海藻***糖ml。困难,不适用于工业放大Ⅲl。随着固定化技术的提来源于SerratiaplymuthicaAS9的蔗糖异构酶高,通过化学或物理手段将微生物细胞固定于某一是另一种研究较多的蔗糖异构酶。但前期研究结果区域内,。因此,与游离细胞生产异麦芽***。为了获得热稳定较高的突变体,利用B定化细胞具有简化下游T艺、连续操作生产、提高因子位点选择结合定点突变技术构建了3种突变催化剂稳定性和操作稳定性、可重复使用性等优点。体,E175N、K576D和E175N/K576D。在45℃培养近年来,已报道的固定化细胞转化法主要有海条件下,、、,热稳定性提高,同时异麦芽***糖定化细胞不仅可以提高异麦芽***%、%、%湖。此外,为善其应用性能。,Pilak等采用了类似于“战舰固定化细胞的异麦芽***/(h·g),且与策略”的半模拟蛋白质工程策略,,其操作稳定性提高i粥i。随后Mundraplymuthica的SIase进行了7次循环突变,共涉及等将相同来源的细胞利用响应面分析法优化了该55个位点,最终获得了一株三重突变体Y219L/同定化过程,在海藻酸盐质量浓度为5g/dL、细胞载D398G/V465E。该突变体的最适反应温度从30℃提量为5g/L时,达到异麦芽***糖最大产率,且将异麦高到35℃,热稳定性和催化效率都明显提高[45]。芽***糖的产量提高了400殇[49]。,采用响应面对异麦芽***糖的产物特异性较低。为了克服上述缺法优化了固定化工艺,同时评估了明胶和谷氨酰***点,,利用定点突变技术获得突变体Q299E,其底胞颗粒网状化的影11向][50l。结果表明,用3g/dL海藻酸物转化率从(±)%±)%1461。此钠同定细胞,细胞同定化质量浓度为47g/dL,添加外,***化钙、/dL的谷机突变,获得的F164L突变体将底物转化率提高了氨酰***%[471。后其蔗糖转化率还能保持50%~60%。,其蔗糖最大转化率为53%~59%.且能够在480hiN的固定化应用●■■_内保持较高活性。降低温度对所得异麦芽***糖结晶异麦芽***糖在自然界中的含量微乎其微,且提后,%『51]。Li等将表达Slase基因取困难,与其市场需求相去甚远。***糖难度较大,并且容易污染环境。因此,对于钠溶液中,并加入***化钙溶液制备固定化细胞微异麦芽***糖的生产,国内外大都采用生物转化法,球。。作为生物转化87%,且能够在酶反应器中连续30d保持稳定¨6i。异麦芽***糖中重要酶制剂,,Li等助于提高其催化性能及稳定性,实现生物酶的回收又优化了其同定化条件,得出2g/dL的海藻酸钠和或重复使用。3g/dL的***化钙为最优固定化条件,,采用柱式反应器连续生产微生物转化法是利用整个微生物细胞来生产40d后,异麦芽***糖产率(转化率)还可高达83%阻i。异麦芽***糖,也包括游离细胞转化法和固定化细胞除此之外,还有其他一些微生物用于海藻酸盐固定万方数据:..化细胞生产异麦芽***糖,比如Klebsiellasp.[5354]、包括交联、包埋和吸附。Contesini等将来源于PrubrumE551、]等。、戊二醛和聚乙烯亚***,得到稳定的固定化细胞微球,可重复使固定化Slase,所得固定化Slase的异麦芽***糖转化用24个批次,异麦芽***糖产率(转化率)高达89%~率分别为30%乖H60%『591。随后又将铁铝酸四钙吸附94%冈。Krastanov等利用中空纤维膜反应器同定化的同定化条件进行了优化,,同定化细胞的催化异麦芽***糖转化率提高到63%例。%,且在生物反应器的循环模式酶的稳定性显著提高,在循环使用13个批次后还下,质量浓度40~60g/dL的底物在36~48h内的转能保持96%的高转化率16]l。与包埋和吸附方法相比,化率均能达到90%以上两I。随后义利用壳聚糖一戊二交联法固定化酶更加稳定,酶不易脱落,。Wu等将SIase交联同定到聚赖氨酸修饰的介定,所得同定化细胞的底物转化率高达94%f翮。孔二氧化钛上,其酶活力回收率高达93%.,在连续反应条件下其半衰期可细胞固定化具有细胞自溶、细胞代谢导致产物达114h,使用16个批次后仍能保持95%的蔗糖转浓度低等缺点。同时,固定化细胞生产异麦芽***糖,化率旧】。此外,作者也以来源于Pantoeadispersa的存在菌体浓度低、生产强度弱的缺陷伊l,因此,酶转蔗糖异构酶为模型酶,分别采用了硅球一戊二醛吸附化法受到越来越多的关注。酶转化法是指将蔗糖异交联法和戊二醛一葡聚糖醛交联法制备了交联酶聚构酶从微生物中分离出来,通过游离酶或同定化酶集体,大幅提高了同定化酶的催化性能『62删。目前关转化制备异麦芽***糖。常用的Slase的固定化方法于固定化细胞或酶生产异麦芽***糖的研究见表3。表3固定化细胞或酶生产异麦芽***糖Table3Isomaltuloseproductionbyimmobilizedcellsorenzymes。+.曩i=“~60循环7次后仍稳定Erw