文档介绍：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法:
凯式定氮法(Kjedahl法)
紫外吸收法
双缩脲法(Biuret法)
Folin-酚试剂法(Lorry法)
考马斯亮蓝法(Bradford法)
(一)凯式定氮法
原理:
蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,蛋白质含量。
蛋白质含量=含氮量*
.蛋白质中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4 作用下,硝化生成(NH4)2SO4,反应式为:
2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 (其中CuSO4做催化剂)
在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH3 ,收集于 H3BO3 溶液中,反应式为:
(NH4)3SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4
2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量,反应式为:
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
干扰物质:
非蛋白氮
(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离)
缺点:
操作比较复杂、费时(8-10小时)
灵敏度低,-。
优点:
测定结果准确、干扰少
常用于标准蛋白质含量的准确测定。
(二)双缩脲法(Biuret法)
原理:
双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或通过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物在540nm处有最大吸收,颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。
干扰物质:
硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等
缺点:
灵敏度低1-20mg
优点:
快速(20-30min)、干扰物质少
不同蛋白质产生颜色的深浅相近
此法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
(三)紫外吸收法
原理:
蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm附近具有最大吸收,且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大,因此测定280nm处的吸光度值可用于蛋白质含量的测定。
核酸对紫外光有很强的吸收,在280nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克),但核酸在260nm处的吸收更强,其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍,而蛋白质则相反,280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常:
纯蛋白质的光吸收比值:A280/A260
纯核酸的光吸收比值: A280/A260
蛋白质浓度=×A280-×A260 (mg/ml)
干扰物质:
嘌呤、嘧啶、核酸等
(可适当校正核酸的干扰)
缺点:
准确度较低、干扰物质多
优点:
简便、灵敏(50-100 μg) 、快速(5-10 min)
不消耗样品,测定后仍能回收使用
此法适用于只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。