文档介绍：实时荧光定量PCR技术 的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) RTQ-PCR
荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中,加入荧光集团,利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控,最终对初始模板进行定量.
实现了PCR从定性到定量的飞跃。
在此技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:
在20世纪90年代早期TaqDNA聚合酶的5´核酸聚合酶活性的发现,它能降解特异性荧光标记探针,因此使得间接检测PCR产物成为可能。
荧光双标记探针的运用使得在一密闭的反应管中能实时的检测反应全过程。
基本的PCR
涉及两个寡聚合甘酸引物,长度为17-30个核苷酸,位于所要扩增的DNA序列两侧。当DNA变性后,引物可以与其相反的链进行杂交而且引物的方向使聚合酶可延两引物质之间的区域进行DNA的合成反应。延伸反应的结果是产生两个双链的靶区域,从而可以进行第二轮的杂交和延伸反应。第三轮产生的两个双链分子完全是双链形式的靶区域。通过热变性,引物杂交,和延伸的重复循环,特异的DNA靶片段很快就会以指数积累起来。在22个循环后,预计扩增量可达到106
实时定量PCR
就是对原始材料定量的PCR ,理论上讲,其实材料(靶序列)和PCR产物的量在任意一循环中都存在一个数量关系,但是实际操作中,扩增反应得到的产物的量是不同的。Higuchi等人最早用溴化乙锭来对扩增的PCR产物定量,扩增出的越来越多的双链DNA 结合它就会使荧光增强。但缺点是,无论是特异性的产物还是非特异性的产物都可以产生信号,
荧光定量PCR与常规PCR的区别
常规PCR技术:
对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析(常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物)
荧光定量PCR技术:
对PCR扩增反应中每一个循环的产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析(实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。)
实时荧光定量PCR的特点
特异性更强
灵敏度高
可直接对产物进行定量
解决PCR污染问题
自动化程度高、操作简单
起点定量与终点定量
定量原理
     PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。