文档介绍：一、实验目的:
1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项;
2、掌握 3, 5-二硝基水杨酸(DNS)比色定糖的原理和方法;
3、掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法;
4、掌握酶蛋白分离提纯的原理;
5、掌握酶的比活力测定及其计算方法;
6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法;
7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。
称量技术:
1、了解电子天平的用途
2、了解电子天平的工作原理
3、掌握电子天平的使用方法
4、掌握电子天平使用前后的注意事项
离心技术:
1、了解离心机的基本原理和用途
2、了解离心机的类型和用途
3、了解离心机的型号和控制版面
4、掌握离心机的使用方法
5、掌握离心机使用的注意事项
层析技术:
1、了解层析技术的基本原理
2、了解层析技术的分类情况
3、了解各种层析技术的原理
4、掌握凝胶层析技术
光谱分析技术:
1、学****掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理
2、了解仪器结构和分类
3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项
电泳技术:
1、了解电泳的基本原理
2、了解电泳的类型
3、学****SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理
4、掌握垂直板电泳的操作技术
5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术
6、了解转移电泳的基本原理和操作方法
7、了解双向电泳的基本原理和操作方法
二、实验原理:
1、蔗糖酶的提取:
①酵母菌的基本特征:
单细胞,椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm,宽1-5μm。
②生物材料破碎方法:
机械(匀浆)法
①研钵
②玻璃或Teflon研棒匀浆器(50mL)Teflon:聚四***乙烯
先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高,适用于少量组织和脏器。
③高速组织捣碎机(-1L)
将材料配成稀糊状液,放置于筒内约 1/3 体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
④高压匀质机(XL)
高压下的细胞通过阀门流出时,细胞内外压力同时降低,但由于细胞膜的作用,胞外压力瞬间降至常压,而胞内压力相比之下降低较慢,从而在细胞内外形成压力差,使细胞膜破裂。
优点:快速,产热小,对蛋白损伤小,破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上
超声波处理法
用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,常在 30 至 60Hz 频率下处理 10-15 分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。
反复冻融法
将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。设备简单、效率不高,时间长,注意蛋白酶!
化学处理法
有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
溶胞作用(酶溶解法)
用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。
自溶法
将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下,细胞结构在自身所具有的各种水解酶(如蛋白酶和酯酶等)的作用下发生溶解,使细胞内含物释放出来。
2、蔗糖酶的纯化:
①酶与蛋白质纯化过程的独有特点:
(1)特定的一种酶在细胞内的含量很少……纯化困难
(2)可以通过测定活力的办法加以跟踪……寻找关键
②酶的纯化方法:
酶的蛋白属性;
***电离:
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外,氨基酸残基侧链中某些基团,在一定的溶液 pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
等电点(isoelectric point, pI):
当蛋白质溶液处于某一pH时,蛋白质解离成正、负离子的趋势相等,即成为兼性离子,净电荷为零,此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。
大分子(胶体):
分子量可自1 万至100 万之巨,其分子的直径可达 1~100nm,为胶粒范围之内。
稳定的因素:
􀁺颗粒表面电荷
􀁺水化膜
调节酶溶解度的方法;有机溶剂分级沉淀
改变离子强度; 盐析硫酸铵分级沉淀(反抽提法)
反抽提法(Back Extraction)
例: RNA聚合酶 42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀
通常方法:先 33%-------再 50%
反抽提法:再 42%
将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来,然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。蛋白从溶液中沉淀析出十分容易,沉淀在溶液中溶解有高特异性。
改变pH或温度;
改酶变在介未电纯常化数之;前 PI也是未知的,pH不宜