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低,标志时间长,温度高,标志时间应短。FITC0-4℃以6-12h为宜,20-25℃以1-2h为宜,37℃30-45min为宜。pH低时,标志较慢,pH值偏高(大于10),抗体易变性,pH值最为适合。抗体蛋白含量低,标志慢,以每毫升含20-25mg蛋白为宜。至于标志方法,各有特色,但均不可以去除非特异荧光染色要素。透析法合用于小体积的标志。,应立刻进行纯化办理,以除去或降低非特异性染色和特异交错染色。其步骤以下:标志抗体溶液↓透析或凝胶过滤去除游离荧光色素(粗制荧光抗体)DEAE-纤维素层析去除过分标志的蛋白分子(精制荧光抗体)↓抗原交错汲取或组织制剂汲取去除特异交错反响的标志杭体(免疫纯荧光抗体)依据免疫荧光试剂的详细用途,纯化的方法能够不一样,其实不是每一种荧光试剂都须经过以上所有过程。关于某些细菌诊疗试剂,只需除掉游离荧光素就能够,检测病毒抗原的荧光抗体一般要求下述办理:(1)游离荧光素的去除掉除标志过程中未与蛋白质联合的游离荧光素,是纯化标志试剂的最基本要求,不经过这一步办理,任何免疫荧光试剂都不可以应用。①半透膜透析法利用荧光色素分子能够经过半透膜,而蛋白分子则因分子量大不可以经过的原理,逐渐将游离色素除掉。先将标志好的抗体溶液装于透析袋或玻璃纸袋内,注意使液面上留有必定空间,扎紧袋口,先用流动自来水透析5min,再转入PBS(,)或生理盐水中连续透析,外液量起码大于内液量100倍,透析应在低温(0-4℃)下进行,每日换液3-4次,整个透析时间约需1周左右,时间过长简单造成蛋白质变性,影响荧光抗体的质量。取透析液(外液)以紫外线灯检查,若无荧光出现,即可停止透析。②凝胶过滤法利用荧光色素分子和蛋白质分子量的悬殊差异,经过分子筛除掉游离荧光素,一般1h之内即能达成操作,但最好与透析法联合进行。先将标志抗体溶液透析4h,除去大多数游离荧光素和其余小分子物质此后,再进行凝胶过滤,这样有益于保护凝胶柱,延长使用时间。凝胶柱sephadexG25和G50装好后,以洗脱液(/LPBS,)均衡,而后加入样品,样品与柱床容积的比率1:2以下皆可。样品所有进入柱床后,即可进行洗脱。应用此法可使游离荧光素完好除掉,同时荧光抗体能够100%回收。(2)过分标志的蛋白分子的去除掉除游离荧光素后,联合物中存在的未标志的和过分标志的蛋白质,是降低染色效价和出现非特异性染色的主要要素。常用的方法是DEAE-纤维素DEAD-葡聚糖凝胶层析,联合物经过层析柱后,过分标志的部分(易出现非特异性)被吸附,过低标志的或未标志的部分(易降低敏感性)自由流出,进而能够获取荧光素与蛋白质联合比最适的部分。DEAD-纤维柱用PBS均衡后,柱上端放一大小适合的滤纸片,翻开下口,调停流速至每分钟10-20滴左右,待柱上液面剩一薄层PBS时,用吸管滴加标志样品,样品进入柱床尚离一薄层时,用适当PBS冲刷管壁,,,用20%磺基水杨酸液试测洗脱液。待蛋白出现阳性反响时即可采集,蛋白反响阴转时停止采集,该洗脱液即为纯化的标志抗体。(3)特异交错或额外应用性标志抗体的去除掉除特异交错或额外应用标志抗体,常用组织粉末汲取法,最常用的是肝粉,这一步办理对标志的抗体来说,损失是很大的,一般可省去这一步。,使用前须做特异性测定、敏感性判定以及纯度测定后,才可正式用于荧光抗体染色。参照文件[1]殷震、刘景华、动物病毒学,科学第一版社,1985[2]刘玉斌、敬仕金,动物免疫学实验技术,吉林科学技术第一版社,1989[3]徐宜为,免疫检测技术,科学第一版社,1991[4]杜平,医用实验病毒学,人民军医第一版社,1995[5]北京医学院微生物学教研室,实验免疫,人民卫生第一版社,1980南京农业大学,牲畜传得病学(第二版),农业第一版社,1986一、荧光素荧光是指一个分子或原子汲取了赐予的能量后马上惹起发光,停止能量供应,发光也刹时停止(一般连续10-7~10-8s)。能够产生光亮荧光的染料物质,称荧光色素。目前主要常用的荧光色素有以下3种:(一)异硫***酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,GITC)呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶,性质稳固,在室温下能保存2年以上,在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。最大汲取光谱为490~495nm,最大发射光谱为520~530nm,体现黄绿色荧光,(图3-5)。在碱性条件下,FITC的异硫***酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰***化而形成硫碳氨基键,成为标志荧光免疫球蛋白,即荧光抗体。反响式以下(图3-6):一个Ig分子上最多能标志15~20个FITC分子。