文档介绍：该【一种山参发根及其培育方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【9】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【一种山参发根及其培育方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种山参发根及其培育方法一种山参发根及其培育方法本发明公开了一种山参发根及其培育方法,以山参根、茎及叶片等为外植体,用活化了的发根农杆菌进行转化,使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中,表达形成毛状根,每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选,逐步建立起山参发根悬浮培养无性系。提供了一种新的山参资源,能够工业集约化生产,不需要占用耕地,不受天气、病虫害等自然界条件的影响,实现了山参有效药用成分生产化室内。【专利说明】一种山参发根及其培育方法【技术领域】[0001]本发明公开了一种山参发根及其培育方法,开辟了一个山参开发利用的新途径,为山参发根生产天然药物提供了可能,属于生物【技术领域】。【背景技术】[0002]发根农杆菌A4具有转移其Ri质粒上的基因,能诱导药用植物产生发状根,该发根能在液体培养基内快速生长,并表达药用植物的有效药用成分。山参()根内含有人参皂苷较多,有些特殊人参皂苷仅在山参中存在,具抗癌作用,用量极微就有很好的疗效。[0003]目前,国内主要是从山参参根内提取人参皂苷供药用。但天然资源受气候的影响,季节性强,病虫害等也会严重影响山参的产量和质量;扩大山参的种植,必定与粮争地,而我国的土地资源十分有限;而且,山参入药需15年以上的时间,其根头小,单产低,严重制约山参在生产上的应用。近30年来,随着生物技术的发展,利用发根农杆菌诱导药用植物产生发根,并利用发根来生产药用植物有效成分研究得越来越深入,这是因为其有以下优点:第一,天然山参资源有限;第二,山参中有无法替代的、特效的、高经济价值的药用成分,第三,可以实现山参中有效药用成分的室内可控生产。[0004]目前国内外均未见转化山参发根成功的报道。[0005]【发明内容】本发明提供一种山参发根,解决了人工种植山参生长周期长、繁殖速度慢,遗传上不够稳定等不利因素,实现了室内生产山参。[0006]本发明还公开了上述山参发根的培育方法,以山参根、茎及叶片等为外植体,用活化了的发根农杆菌进行转化,使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中,表达形成毛状根。[0007]本发明提供的山参发根,又称之为发根(hairyroot);其特征在于:以山参根、茎及叶片等为外植体,用活化了的发根农杆菌进行转化,使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中,表达形成毛状根,每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选,逐步建立起山参发根悬浮培养无性系。[0008]本发明公开的山参发根的制备方法,其技术解决方案如下:以山参根、茎及叶片等为外植体,用活化了的发根农杆菌进行转化,使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中,表达形成毛状根。每一根山参发根即为一个单克隆,经过继代培养和多次筛选,逐步建立起山参悬浮培养无性系。[0009]具体步骤如下:1、外植体的预培养:取山参新鲜、健康的根或茎或叶片,洗净;%的升***灭菌lOmin,无菌水漂洗4次,每次不少于Imin,然后吸干表面水分;,转移到已灭菌的1/2MS固体培养基上(每瓶5片);于黑暗条件下预培养2~7d。[0010]2、发根农杆菌的制备:挑取发根农杆菌单菌落,接种于5mL液体YEB内,28°C黑暗条件下振荡培养过夜,于次日接种到50ml液体YEB中继培养4~6h后备用。[0011]3、山参叶片与发根农杆菌共培养转化:将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根农杆菌菌液中,感染5~10min,然后,用无菌滤纸将菌液吸净;再接种于含抗生素1/2MS固体培养基上,约经过30cT50d培养生出发根。[0012]4、发根培养:去菌培养:切割下由外植体上长出的发根,置于含抗生素(头孢噻吩30(T500mg/L)1/2MS固体培养基上,进行去菌培养,每:T5d转继代I次,进行3飞次;扩大培养:,于黑暗条件下,室温22°C~25°C,llOrpm,悬浮培养。[0013]山参发根无性系的建立:经:T5代的悬浮培养,按发根克隆的来源分别建立不同的无性系。[0014]此外,利用本发明的山参发根产生的愈伤组织,还可筛选出细胞悬浮培养无性系。[0015]本发明与山参栽培根相比的积极效果在于:提供了一种新的山参资源,能够工业集约化生产,不需要占用耕地,不受天气、病虫害等自然界条件的影响,实现了山参有效药用成分生产化室内;解决了人工种植山参的生长周期长,需15年以上才能采收I次,并且受气候及病虫害影响大导致质量不稳定的问题;同时也克服山参繁殖速度慢,遗传上不够稳定等不利因素。山参发根可以周年不断地提供山参资源,并能保证质量的稳定,由于山参发根是在人工控制下的无菌培养,生长周期短(约40d),因此处理工艺成本较低。[0016]本发明山参发根具有生物学特征如下:1、发根生长形态和农杆碱的鉴定:转化的山参发根无向地性,随机交叉‘无序’生长,多‘根毛’,多分枝,生长快,具有典型的转化发根特征。农杆碱的鉴定表明Ri质粒的T-DNA的确整合到山参细胞核DNA上,因为发根农杆菌所含冠瘿碱合成酶基因只能在真核生物中表达。[0017]2、生长曲线:为一典型的S形曲线。培养30d可增殖20倍(参见图4)。[0018]3、山参发根培养基的筛选:对常用的多种培养基进行比较的基础上,对基培养基进行了优化筛选。认为:1/2MS液体培养基对其生长有利。pH5.(。[0019]4、pH对山参发根生长的影响:在pH5.(,山参发根生长良好。[0020]5、蔗糖浓度对山参发根生长的影响:在发根培养中,蔗糖是作为碳源和能源,还可调节培养液渗透压,以蔗糖含量为2.(%为宜。[0021]6、外源激素对山参发根生长的影响:本山参发根在无激素培养液内可自行生长。[0022]7、山参发根次生代谢物质:HPLC分析表明,发根中人参皂苷与原植物中所含人参阜苷相同,含量相近。[0023]8、光对山参发根生长的影响:在室内自然光下,光对山参发根生长表现较强的抑制作用,其生物量仅为黑暗培养条件下的1/3。【专利附图】【附图说明】[0024]图1是实施例1转化山参发根培养的实物照片。[0025]图2是实施例2转化山参发根培养的实物照片。[0026]图3是实施例3转化山参发根培养的实物照片。[0027]图4为山参发根生长曲线。[0028]【具体实施方式】实施例1取山参新鲜健康的根洗净;%的升***灭菌lOmin,无菌水漂洗4次,每次不少于Imin,然后吸干表面水分;,于黑暗条件下预培养疒7d。将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根农杆菌菌液中,感染5~10min0再接种于含抗生素1/2MS固体培养基上(蔗糖含量为2%),22°C~25°C下,约经过30d至50d培养生出发根。切割下长出的发根,置于含抗生素头孢噻吩300mg/L的1/2MS固体培养基上,进行去菌培养。在黑暗条件下,室温22~25°C,IlOrpm,将无菌的发根经3飞代的悬浮培养,可获得不同的发根无性系(参见图1转化山参发根培养的实物照片)。[0029]实施例2取山参新鲜健康的茎洗净;%的升***灭菌lOmin,无菌水漂洗4次,每次不少于Imin,然后吸干表面水分;,于黑暗条件下预培养疒7d。将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根农杆菌菌液中,感染5~10min0再接种于含抗生素1/2MS固体培养基上(蔗糖含量为3%),22°C~25°C下,约经过30d至50d培养生出发根。切割下长出的发根,置于含抗生素头孢噻吩400mg/L的1/2MS固体培养基上,进行去菌培养。在黑暗条件下`,室温22~25°C,IlOrpm,将无菌的发根经3飞代的悬浮培养,可获得不同的发根无性系(参见图2)。[0030]实施例3取山参新鲜健康的叶片洗净;%的升***灭菌lOmin,无菌水漂洗4次,每次不少于Imin,然后吸干表面水分;,于黑暗条件下预培养疒7d。将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根农杆菌菌液中,感染5~10min0再接种于含抗生素1/2MS固体培养基上(蔗糖含量为4%),22°C~25°C下,约经过30d至50d培养生出发根。切割下长出的发根,置于含抗生素头孢噻吩500mg/L的1/2MS固体培养基上,进行去菌培养。在黑暗条件下,室温22~25°C,IlOrpm,将无菌的发根经3飞代的悬浮培养,可获得不同的发根无性系(参见图3)。【权利要求】,其特征在于:以山参根、茎及叶片等为外植体,用活化了的发根农杆菌进行转化,使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中,表达形成毛状根;每一根山参发根即为一个单克隆,经过继代培养和多次筛选,逐步建立起山参悬浮培养无性系。2.—种山参发根的制备方法,包括以下步骤:1)外植体的预培养:取山参新鲜、健康的根或茎或叶片,洗净;%的升***灭菌lOmin,无菌水漂洗4次,每次不少于Imin,然后吸干表面水分;,转移到已灭菌的1/2MS固体培养基上;于黑暗条件下预培养2~7d;2)发根农杆菌的制备:挑取发根农杆菌单菌落,接种于5mL液体YEB内,28°C黑暗条件下振荡培养过夜,于次日接种到50ml液体YEB中继培养4~6h后备用;3)山参叶片与发根农杆菌共培养转化:将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根农杆菌菌液中,感染5~10min,然后,用无菌滤纸将菌液吸净;再接种于含抗生素1/2MS固体培养基上,约经过30cT50d培养生出发根;4)发根培养:去菌培养:切割下由外植体上长出的发根,置于含抗生素(头孢噻吩30(T500mg/L)的1/2MS固体培养基上,进行去菌培养,每:T5d转继代I次,进行3飞次;扩大培养:将无菌的发根1.(`^移入盛有501!^1/2MS液体培养基的IOOmL三角瓶内,于黑暗条件下,室温22°C~25°C,llOrpm,悬浮培养;山参发根无性系的建立:经3飞代的悬浮培养,按发根克隆的来源分别建立不同的无性系。