1 / 8
文档名称:

一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法.docx

格式:docx   大小:19KB   页数:8页
下载后只包含 1 个 DOCX 格式的文档,没有任何的图纸或源代码,查看文件列表

如果您已付费下载过本站文档,您可以点这里二次下载

分享

预览

一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法.docx

上传人:开心果 2024/4/18 文件大小:19 KB

下载得到文件列表

一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法.docx

相关文档

文档介绍

文档介绍:该【一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法 】是由【开心果】上传分享,文档一共【8】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法专利名称:一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法技术领域:本发明涉及生物检测技术领域,特别涉及一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法。背景技术:人星状病毒(Humanastrovirus,HAstV)是无包膜的单股正链RNA病毒,属于星状病毒科哺乳动物属。HAstV是导致幼小动物产生腹泻的一种重要病原,世界各地均已有星状病毒感染的报道,既可散发也可以引起暴发流行,亦可引起医源性感染。与轮状病毒相似,星状病毒感染多发生在2岁以内尤其是I岁以内的婴幼儿。目前认为人星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因,仅次于轮状病毒。此外,老年人和免疫缺陷患者也是星状病毒感染的高危人群,人类免疫缺陷患者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生星状病毒感染均已有报道。人星状病毒亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一。因此,疾病预防控制机构以及医院急需特异性强,敏感性高,操作方便,可用于胃肠炎等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断的方法。1975年Madeley首次在电镜下观察到星状病毒,由于病毒颗粒表面有56个星状突起,故而得名。人星状病毒颗粒直径为2841nm,当病毒存在于高pH值环境下,其表现为典型的星状形态。它的基因组从5’端到3’端包括一个约85个核苷酸的5’非编码区、3个开放读码框架(ORFla、ORFlb,0RF2)、1个约80个核苷酸的3’非编码区和I个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。ORFla和ORFlb编码非结构蛋白,ORFla编码丝氨酸蛋白酶,且其下游存在I个核定位信号;0RFlb编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RDRP),RDRP是通过核糖体读框移位机制合成的I个融合蛋白。HAstV衣壳蛋白由0RF2编码合成。在病毒复制的过程中,所感染的细胞内可检测出2种病毒特异性的RNA,,,2种RNA的3’端均具有多聚腺苷酸尾。亚基因组RNA包含了全部的0RF2序列,可作为mRNA表达衣壳蛋白。0RF2编码产物至少包括2个区域第I个区域(I415个氨基酸)在各血清型之间是高度保守的;第2个区域(416个氨基酸结束)是高度变异的,病毒的中和抗原决定簇即在此区域内。人星状病毒在细胞培养中增殖困难,且多数星状病毒在细胞培养物中不产生细胞病变,这为病毒分离带来了难度。目前人星状病毒的常规检测方法主要是应用电镜直接检测粪中的病毒颗粒,或用免疫诊断方法检测粪中的病毒抗原和血清中的特异性抗体。电镜检查病毒灵敏度较低,容易出现漏检;免疫学方法特异性有待提高,而且都费时费力。传统的RT-PCR也被用于人星状病毒,但检测时间需要6小时。发明内容本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种人星状病毒核苷酸的检测引物。本发明的另一目的在于提供与上述检测弓丨物配合使用的探针。本发明的另一目的在于提供一种检测人星状病毒核苷酸的方法,该方法通过使用上述检测引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测,能够快速简单地判断样品是否有人星状病毒,为人腹泻和胃肠炎的病原学诊断提供科学依据。本发明的目的通过下述技术方案实现一种人星状病毒核苷酸的检测引物,所述的检测引物由正向引物和反向引物组成,其核苷酸序列如下正向引物5,-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3,;反向引物5’-ATCACACTTC-3,。与上述检测引物配合使用的探针的核苷酸序列如下探针5’-AAATGCGATGGAG-3’,该探针一端标记有报告荧光染料,另一端标记有淬灭荧光染料;优选的,该探针的5’端标记有报告荧光染料,3’端标记有淬灭荧光染料。所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5。所述的淬灭突光染料优选为Tamra、Rox>Dabcyl、BHQl或BHQ2。根据TaqMan技术,在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针,例如将报告荧光染料标记的探针的5’端,淬灭荧光染料标记在探针的3’端,两者构成能量转移结构,即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收,当二者距离变远时,抑制作用减弱,报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中,探针同模板上的目的扩增片段杂交,由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性,在扩增延伸阶段将探针切断,淬灭荧光染料的抑制作用消失,报告荧光染料信号增强,在扩增延伸阶段将探针切断,淬灭荧光染料的抑制作用消失,报告荧光染料信号增强,从而实现对人星状病毒的检测。一种检测人星状病毒核苷酸的方法,包括如下步骤以待检样品RNA为模板,利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增,每个循环结束采集数据,反应结束后根据扩增曲线判定结果。所述的检测人星状病毒核苷酸的方法的实时荧光RT-PCR反应体系包括如下组分2·5μLlOXOneStepRNAPCRBuffer,2yLdNTP(),上述正向引物和反向引物(10μM),(10μΜ),,(40U/yL),(5U/yL),5yLRNA,。当然,可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其它类型的探针,以适用不同方法的荧光PCR检测。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明根据人星状病毒基因组序列设计的引物特异性好,用于实时荧光RT-PCR检测的灵敏度高。(2)本发明检测方法准确性高,灵敏度高,其能够快速简单地判断样品是否有人星状病毒,为人腹泻、胃肠炎的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。图1是人星状病毒核酸Real-timeRT-PCR检测方法的特异性试验结果图。图2是人星状病毒核酸Real-timeRT-PCR检测方法的灵敏性试验结果图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。实施例1引物和探针的设计从NCBI数据库下载所有的已知人星状病毒全基因组序列,并进行比较分析,选择无二级结构且高度保守的区段,设计引物和探针,其序列如下正向引物5,-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3,;反向引物5,-ATCACACTTC-3’。探针的序列为5’-AAATGCGATGGAG-3’;该探针的5’端用报告荧光染料VIC标记,3’端用淬灭荧光染料BHQ2标记。实施例2人星状病毒核酸荧光RT-PCR条件的优化利用灭活的人星状病毒作为待检样品,用商业RNA提取试剂盒提取病毒基因组RNA,分别分装后储存于_20°C备用。(I)引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下,/L作倍比连续稀释,通过试验结果的分析比较,。(2)镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下,将MgCl2的浓度从lmmol/L至10mmol/L以lmmol/L递增,确定镁离子最佳镁离子浓度为5mmol/L。(3)反转录酶(AMVRnaseXL)用量的优化使用不同浓度反转录酶的试验结果比较,选定5U作为反转录酶的用量。(4)TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量的优化实验结果,选定5U作为Taq酶的用量。(5)dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测,综合评估后选lmmol/L作为dNTPs的使用量。(6)探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下,/L作倍比连续稀释后进行检测,通过试验结果的分析比较,。利用实施例1的引物和探针进行反应体系的建立,最后确定采用的人星状病毒实时荧光RT-PCR反应体系为25μI体系,所需各组分及相应浓度见表I。表I人星状病毒实时荧光RT-,其特征在于所述的检测引物由正向引物和反向引物组成,其核苷酸序列如下正向引物5’-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3’;反向引物5’-ATCACACTTC-3,。,其特征在于所述探针的核苷酸序列如下5’-AAATGCGATGGAG-3’;该探针的5’端标记有报告荧光染料,3’端标记有淬灭荧光染料。,其特征在于所述探针的5’端标记有报告荧光染料,3’端标记有淬灭荧光染料。,其特征在于所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5;所述的淬灭荧光染料优选为Tamra、Rox,Dabcyl、BHQl或BHQ2。,其特征在于包括如下步骤以待检样品RNA为模板,利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增,每个循环结束采集数据,反应结束后根据扩增曲线判定结果。,其特征在于所述的实时荧光RT-PCR反应体系包括如下组分2·5μLlOXOneStepRNAPCRBuffer,2μLdNTP(各2·5mM),上述正向引物和反向引物(10μM),(10μΜ),,(40U/yL),(5U/yL),5yLRNA,。全文摘要本发明公开了一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法,属于生物检测技术领域。一种人星状病毒核苷酸的检测引物,由正向引物和反向引物组成,。;该探针一端标记有报告荧光染料,另一端标记有淬灭荧光染料。检测人星状病毒核苷酸的方法,包括如下步骤以待检样品RNA为模板,利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增,每个循环结束采集数据,反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明根据人星状病毒基因组序列设计的引物特异性好,用于实时荧光RT-PCR检测的灵敏度高。