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胰岛素在制备促进颌骨组织愈合的药物中的用途的制作方法.docx

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胰岛素在制备促进颌骨组织愈合的药物中的用途的制作方法.docx

上传人:开心果 2024/4/18 文件大小:29 KB

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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。胰岛素在制备促进颌骨组织愈合的药物中的用途的制作方法专利名称:胰岛素在制备促进颌骨组织愈合的药物中的用途的制作方法技术领域:本发明涉及胰岛素的一种药用用途。具体而言,本发明涉及胰岛素可以作为促进动物颂骨组织愈合的药物。本发明首先将胰岛素作用于颂骨组织的体外培养细胞,促进了颂骨成骨细胞的增殖;其次,本发明将胰岛素局部给药作用于颂骨组织,胰岛素增强了大鼠拔牙窝颂骨组织愈合的能力。背景技术:胰岛素由51个氨基酸组成A,B两条肽链,A链含21个氨基酸,B链含30个氨基酸,两条肽链之间借两个二硫键联结,A链的第6与第11位氨基酸之间也有一个二硫键[LuH,KrautD,,144(1):346-,E.,.,-graftsurvivalwiththelong-term,localdeliveryofinsulin,insulin-likegrowthfactor—I,andbasicfibroblastgrowthfactorbyPLGA/,105(5):1712-1720.]。,。在酸性环境(-)较稳定,在碱性溶液中易被破坏,可形成锌、钴等胰岛素结晶。又由于其分子中酸性氨基酸较多,可与碱性蛋白如鱼精蛋白等结合,形成分子量大、溶解量低的鱼精蛋白锌胰岛素。此种制剂注入皮下或肌肉吸收较慢,作用时间长,为长效胰岛素。从胰岛分泌的胰岛素,经门脉进入肝脏,40%-50%在肝内分解,其余进入体循环分布于全身。从静脉注射胰岛素,90%在20min内从血液中消失,绝大部分被组织吸收或被肝脏灭活。胰岛素的生理作用主要为促进合成代谢,主要靶器官是肝脏、脂肪组织、骨骼肌[KrakauerJC,McKennaMJ,BudererNF,,44(7):775-,BexM,,sex,,80(4)1194-,Ackert-BicknellCL,-Ihaveincreasedbodyfat,reducedbonemineraldensity,(5)1046-1058.]。胰岛素使进食后吸收的葡萄糖大量转化成糖原贮存,抑制糖原异生。在对蛋白质代谢调节方面,胰岛素主要对蛋白质合成和贮存起作用,它通过与受体结合能促进氨基酸转运入细胞,并作用于核糖体,增加核糖核酸和脱氧核糖核酸生成,从而进一步增加蛋白质合成Devlin,,,12(12):2061-2067.]。姨岛素虽然是目前治疗糖尿病的主要药物,但是它分子量大,半衰期短,脂溶性差,不易透过生物膜,易被胃肠道的酶所降解,所以迄今为止胰岛素最为广泛的使用途径是以注射用药为主。采用胰岛素治疗可缓解糖尿病对口腔局部种植体愈合的不利影响,减轻种植体周围因糖尿病而发生的病理变化[Boney,.,Moats_Staats,·,-likegrowthfactor-1(IGF-I)andIGF-,135:1863-,RosenCJ,-likegrowthfactorI,bonemineraldensity,,17(4):570_579.],增强种植体骨愈合能力成为糖尿病患者牙种植治疗的关键。糖尿病是一种常见的内分泌代谢病,是以胰岛素绝对或相对不足所致的血糖及尿糖增高为主要特征并导致糖、蛋白质和脂肪代谢障碍的全身慢性代谢异常综合症。目前中国糖尿病患者已经达到5000万,占世界糖尿病人群总数的1/5,患病率在印度之后居世界第二,并且以每天至少三千人的速度增加,每年增加超过一百二十万。2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)是糖尿病的主要类型,占所有糖尿病患者的90%以上。随着经济的发展、社会老龄化,T2DM患病率逐年增高。从世界范围来看,T2DM已成为严重威胁人类健康的慢性病之一。中华医学会糖尿病学分会于2007年6月至2008年5月在全国的14个省市进行的最新糖尿病的流行病学调查结果显示,%。骨整合的发生是牙科种植体成功的基础,然而高血糖会抑制成骨细胞的分化,还可以对骨基质及其成分产生有害作用,同时影响细胞外基质的粘连、生长、聚集导致糖尿病患者种植体周围出现骨形成障碍。控制血糖最常用最有效的药物就是胰岛素,其生理作用主要为促进合成代谢,胰岛素与细胞结合的程度取决于细胞上的受体数目和其亲和力。受体的数目在正常生理条件下是恒定的,但由于细胞生理状态不同(如生长速度,分化程度,细胞周期等)和外界环境变化的影响,也会发生一定的改变。胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF-D、胰岛素样生长因子2(IGF-2)及其相应受体IR,IGF-IR和胰岛素样生长因子2受体(IGF-2R)都是属于IGFs系统。研究表明,该系统可能对胚胎、神经、骨骼肌和骨骼的发育、细胞增殖和转化等具有极其重要的作用。颂骨组织是面部重要的骨组织。颂骨组织的而整合发生是牙科种植体成功的基础之一。为此,寻找一种更简便易行的药物促进和骨组织愈合具有重要的意义。目前,胰岛素用于牙囊组织已经用些报道,但是胰岛素直接给药颂骨组织的研究还没有。本发明另辟蹊径,胰岛素仅仅局部给药颂骨组织,发现了胰岛素可以有效的促进颂骨组织成骨细胞愈合。这为胰岛素的应用开辟了一个新途径。胰岛素作用于糖尿病病人可能会产生胰岛素抵抗,而局部用药于颂骨组织可以避免胰岛素抵抗的作用,从而促进2型糖尿病病人牙科种植体成功率。此外,由于胰岛素可以体循环分布于全身,从而促进促进合成代谢;本发明采用局部给药,降低了胰岛素给药给予正常人所带来的负面效果,提高了胰岛素在促进颂骨组织成骨细胞增殖的效率。发明内容本发明首先提供了胰岛素的一种药用用途。本发明所述胰岛素在制备促进颂骨组织成骨细胞增殖、促进颂骨组织愈合的药物中的用途,包括用细胞生物学实验检测胰岛素促进体外颂骨组织成骨细胞的增殖;胰岛素局部作用于活体动物的颂骨组织,促进颂骨组织的愈合。本发明所指的胰岛素的药用用途针对的是动物颂骨组织。本发明所述的动物颂骨组织是指颂骨组织在体外培养的成骨细胞以及在动物活体的颂骨组织。本发明提高了胰岛素的效用。本发明采用胰岛素直接作用于颂骨组织,而不是通过静脉注射等其他途径。首先,本发明避免了胰岛素的长期注射而带来的副作用,并为2型糖尿病患者的颂骨组织愈合带来了很大的促进作用。其次,本发明采用局部给药,有效的提高了胰岛素在颂骨组织愈合过程中的效率。图1各浓度胰岛素组在不同时间对成骨细胞增殖的作用(MTT法),*与对照组相比P具体实施例方式实施例1胰岛素对体外培养正常大鼠下颂骨成骨细胞增殖的影响本实施例以SPF级Wistar大鼠为材料,雌雄不限,体重180-220g,6_8周龄。实验方法与步骤1)酶消与组织块相结合的方法培养成年大鼠下颂骨成骨细胞。取Wistar大鼠,断颈处死后,在75%的酒精中浸泡5min;在无菌超净台中使大鼠仰卧,用碘伏棉签消毒大鼠颈部及口腔,于颈部剪开大鼠皮肤,逐层剥离,暴露下颂骨;无菌取出带有肌肉和筋膜的下颂骨,置于75%酒精中洗5-10seC,%NaClO中浸泡lmin,PBS(含100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)反复冲洗3次;拔除牙齿,彻底刮除肌肉、筋膜和牙周组织;将下颂骨用咬骨钳剪碎成约2mmX2mm的骨片,PBS缓冲液反复冲洗至骨碎块呈白色;将骨片置入小培养瓶中,%胰蛋白酶在水浴振荡器中37C、150rpm消化8min,消化6次后终止;收集第2至6次的消化液经200目不锈钢筛网过滤并离心,去除上清后用含20%胎牛血清的L-DMEM(,加NaHC032g,双蒸去离子水1L,,过滤除菌,分装4°C保存。内含100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)重悬细胞;将细胞接种于培养瓶中在37°C、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温孵箱中静置培养40min;差速贴壁除去成纤维细胞,纯化成骨细胞后继续培养经酶消化后剩下的组织块,再次剪碎至ImmX1mm,铺于培养瓶中倒置培养,4h后翻瓶。待细胞长满传代。传代时,差速贴壁40min反复纯化成骨细胞。酶消化法和组织块培养法的细胞均于4换全液,以后每隔4换半液或1/3换液。倒置显微镜下下严密观察细胞生长状况,待细胞长满瓶底80%%胰酶(%EDTA)消化传代培养。取生长良好的第4代细胞用于实验及细胞功能鉴定。2)颂骨组织成骨细胞鉴定将第4代成骨细胞接种在盖玻片上,培养3w后用95%乙醇固定15min,用Gomori钙-钴法进行ALP染色。步骤如下固定好的盖玻片经蒸馏水漂洗后,置入孵育液(3%β-甘油磷酸钠5ml,2%戊巴比妥钠5ml,2%***钙10ml,2%硫酸镁5ml,蒸馏水25ml。)中;37°C孵育2h,自来水冲洗3次;2%***钴中孵育lmin,自来水冲洗;自然干燥,封固。取第4代培养细胞接种于孔底铺有盖玻片的6孔板中,改用含10%新生牛血清的L-DMEM培养液(其中含有50ug/ml维生素C和lOmmol/Lβ-甘油磷酸钠)中培养,每3d换液一次,于第21d,镜下见有较多不透明的矿化结节时取出盖玻片,按茜素红S染钙法进行染色。步骤如下培养皿用PBS洗2次,95%酒精原位固定IOmin茜素红酒精配制,)染色5min;50%酒精去除非特异性着色;自然干燥。将第4代成骨细胞接种在盖玻片上,培养3w后用95%乙醇固定15min,用VanGieson法进行I型胶原染色,步骤如下铁苏木素滴染5min,PBS冲洗3次;自来水振荡返蓝IOmin;苦味酸酸性品红染色5min;95%乙醇快速分化;乙醇脱水,二甲苯透明,树脂封片;光学显微镜下观察并摄像。3)细胞爬片的免疫组化染色制作细胞爬片将对照组和糖尿病组第5代细胞以2XIOVml接种到玻片上,培养5d后,固定细胞。PBS(%吐温)洗5min,放入湿盒;%TritonX-100,置于37°C孵箱孵育15min;将爬片上的TritonX-100甩干,PBS振洗,5minX3次;滴加3%H2O2(^H2O2与IOml纯100%甲醇充分混勻,现用现配,37°C孵箱孵育20min;PBS振洗,5minX3次;滴加适量稀释的抗体,顶α1与IGF-IRα1均以1100稀释,4°C过夜。37°C复温lh,PBS振洗,5minX3次;滴加SP试剂盒中试剂一液,置于37°C孵箱孵育IOmin;PBS振洗,5minX3次;滴加SP试剂盒中试剂二液,置于37°C孵箱孵育IOmin;PBS振洗,5minX3次;滴加DAB显色液(Iml蒸馏水加入浓缩DAB液1滴,现用现配),镜下控制显色;蒸馏水终止显色;苏木素复染anin,水洗,盐酸溶液(70%酒精配制)分化数秒,流动自来水返蓝20min;乙醇脱水,二甲苯透明,树脂封片;染色强度的判断标准阴性-细胞核或胞质中无着色;弱阳性-细胞核或胞质中出现浅黄色染色颗粒;阳性细胞核或胞质中出现棕黄色染色颗粒;强阳性-细胞核或胞质中出现深棕色染色颗粒。4)选择胰岛素适宜浓度每组设12个样本将密度为2XIO4个/ml的细胞接种于96孔板中,细胞融合后换为无血清培养基,次日加入含5%胎牛血清。()L-DMEM(生理糖浓度)、(高糖)浓度H-DMEM的培养液配制的不同浓度(0,10_5M,10_6M,10_7M)胰岛素培养,依次编号为LA,LB,LC,LD;HA,HB,HC,HD;继续培养7d,隔日更换药物和培养基;在培养周期的最后4h,每孔加入20μ1的ΜΤΤ,继续孵育至结束;加入DMS0,于490nm用酶标仪测吸光度(OD)值。MTT法检测成骨细胞的增殖,确定药物最适浓度。实验结果与讨论1)成骨细胞鉴定碱性磷酸酶染色细胞生长21d后,已完全铺满整个盖玻片,ALP染色可见细胞质内有大量棕色颗粒或块状沉淀。矿化结节染色成骨细胞在维生素C,磷酸甘油钠存在条件下,可使胞外基质矿化,并形成多量矿化结节,经茜素红染色呈红色块状沉淀。I型胶原染色成熟的成骨细胞能合成I型胶原,是成骨细胞标志物之一,胶原染色可见大面积粉红色染色。