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材料的获取与处理供试木薯品种为华南8号(SC8)和南植199(NZ199),由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。2017年3月24日,种植于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所六坡基地。株行距均为80cm。2018年2月25日收获。收获时在离地10cm处砍断种茎,去除20cm顶梢及所有叶片,获得种茎材料。取上述种茎材料进行人工加速老化,设0、2、4、6d4个老化时间(分别用A0、A2、A4和A6表示)。3次重复。参照文献[14]的方法进行老化,获得4种不同活力的种茎材料,去除髓部,液氮冷冻后,于粉碎机中粉碎。粉末保存于–80℃的冰箱中,备用。 。加800μL裂解液至蛋白样品中,参照文献[15]的方法配置溶解液,室温下溶解1h,13000r/min离心5min;分装,每管50μL,用于蛋白定量和SDS–PAGE。参照文献[16]的方法进行蛋白定量;参照文献[17]的方法进行单向SDS–PAGE凝胶电泳检测和蛋白质双向电泳分离。Ⅲ扫描仪(GEhealthcare)扫描脱色后的双向电泳凝胶并保存图像。运用AlphaEaseFC(ChemiImager4400)进行图片数据转换。,对全蛋白质图谱进行蛋白质点统计和定量分析,以蛋白点归一化体积表示其相对表达丰度,以A0的蛋白质双向电泳图谱作为对照,分别与A2、A4和A6的图谱进行两两比对,找出差异蛋白点,编号。再从A6凝胶中选择与A0、A2、A4凝胶共有的、清晰的差异点。重复3次,进行T检验。[18],包括老化途中彻底消失或新生成的差异蛋白质点。选取清晰的点,用特制的挖点枪头挖点,重新编号,。,检测结果通过Mascot软件,从NCBInr、SwissProt和EST数据库分析其名称、功能、亚细胞定位、登录号等信息;,获得差异表达蛋白质的功能分类、生物学过程分析和亚细胞定位的注释。2 ~%SDS–PAGE凝胶,对A0、A2、A4、A6种茎蛋白质进行IEF和SDS–PAGE双向分离、考马斯亮蓝G250染色及扫描后,获得的种茎全蛋白质电泳图图谱较清晰,点较多,蛋白分离情况良好,蛋白质点基本为圆形,无明显拖尾现象,说明已成功分离出木薯种茎全蛋白质。比较木薯种茎差异表达蛋白总数发现,与A0种茎相比,SC8种茎A2、A4、A6的差异表达蛋白质总数分别为38、64和68个,NZ199种茎A2、A4、A6的差异表达蛋白质总数分别为55、63和84个。说明木薯种茎老化程度越高,差异表达蛋白质总数越多。SC8种茎差异表达蛋白质总数呈先快速增加后趋于平缓的变化趋势,而NZ199种茎一直呈快速增加的变化趋势。比较木薯种茎上调、下调表达蛋白质,发现与A0种茎相比,SC8种茎A2、A4、A6的上调表达蛋白质数分别为11、18和25个,NZ199种茎A2、A4、A6的上调表达蛋白质分别为17、23和43个;SC8种茎A2、A4、A6的下调表达蛋白质分别为27、46和43个,NZ199种茎A2、A4、A6的下调表达蛋白分别为38、40和41个。总体上看,种茎下调表达蛋白质数高于上调表达蛋白质数,这与种茎老化程度加深以及蛋白质的合成、修饰、分泌受到影响有关。与A0相比,NZ199种茎A6的下调表达差异蛋白质数小于上调表达差异蛋白质数,这可能与NZ199种茎的抗老化能力较强有关。 差异表达蛋白质的鉴定检测A6凝胶中与A0、A2、A4凝胶共有的、清晰的差异蛋白质点,发现SC8种茎和NZ199种茎分别有19、36个差异蛋白质点。将上述差异蛋白质点进行质谱鉴定与分析,分别成功匹配到17、30个差异蛋白质点,具体信息分别见表1和表2。表1 从SC8种茎鉴定的17个差异表达蛋白质的相关信息表1(续)表2 从NZ199种茎鉴定出的30个差异表达蛋白质的相关信息从表1和表2可知,2个品种种茎均存在不同的蛋白质点鉴定为同一蛋白质的情况,例如:SC8种茎中点号为12、13、15的蛋白质点,NZ199种茎中点号为6和9的蛋白质点,这可能是由蛋白质的降解或者***化、磷酸化修饰等造成的[19]。另外,2个品种木薯种茎的差异蛋白质点功能也基本相似,均含有分子伴侣、碳水化合物和能量代谢、转移、防御及解毒和抗氧化5类相关蛋白质,且在其功能蛋白质中均存在着许多共同的蛋白。2个品种共同的差异蛋白质相对分子质量值为17000~55000,理论等电点为5~7。说明木薯种茎劣变时,主要是这几类小分子质量的弱酸性蛋白质发生了较大变化。从表1和表2还可以看出,差异蛋白质中碳水化合物和能量代谢相关蛋白质,SC8种茎中,NADP+依赖型苹果酸酶(NADP–ME)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、D–3–磷酸甘油酸脱氢酶、拟定肉桂醇脱氢酶下调表达,α–淀粉酶上调表达;NZ199种茎中,苹果酸酶、磷酸甘油酸激酶、拟定甘露醇脱氢酶和类壳三糖苷酶–1蛋白下调表达,烯醇化酶和ATP合成酶β亚基上调表达。差异蛋白质中转移相关蛋白质,SC8种茎中均为拟定谷胱甘肽硫–转移酶parC(GSTs),NZ199种茎中有2个GSTs、1个S–甲酰谷胱甘肽水解酶均上调表达。差异蛋白质中防御相关蛋白质,SC8种茎中均为病程相关蛋白BetvI家族;NZ199种茎中,2个病程相关蛋白BetvI家族和1个脱水蛋白均上调表达。差异蛋白质中解毒和抗氧化相关蛋白质,SC8种茎中均为胞浆亚型2L–抗坏血酸过氧化物酶(APX),且下调表达;NZ199种茎中拟定核氧化还原蛋白1和类异黄***还原酶上调表达,APX和1–脱氧–D–木***糖–5–磷酸还原异构酶蛋白(DXR)下调表达。分子伴侣相关蛋白质,SC8种茎中类热休克同源蛋白70–2和热激蛋白70,NZ199种茎中线粒体亚型X2热激蛋白90–6、热休克同源蛋白70、、,均上调表达。说明种茎劣变会导致种茎细胞受到损伤,种茎为维持自身活力,会启动应激机制进行自身修复。 差异表达蛋白质的GO分析根据UniprotKB(prot/)网站上每个蛋白质的注释及其参与的生化途径,进行功能分类、生物学过程分析和亚细胞定位。从图1可以看出,SC8种茎的17个差异蛋白质中,参与结合功能的蛋白质有9个,参与催化活性的蛋白质7个(催化α淀粉酶活性1个、磷酸甘油酸脱氢酶活性1个、放氧活动1个、氧化还原酶活性4个),参与氧化还原的蛋白质7个(过氧化物酶3个、转移酶4个);NZ199种茎的30个差异蛋白质中,参与结合功能的蛋白质19个,参与催化活性的蛋白质7个,参与氧化还原的蛋白质8个(氧化还原酶5个、过氧化物酶3个)。图1 木薯种茎差异表达蛋白质的GO分子功能分类从图2可以看出,SC8种茎差异蛋白质中,参与对氧化应激反应过程的占22%,参与***分解过程的占22%,参与谷胱甘肽代谢过程的占21%;NZ199种茎差异蛋白质中,参与蛋白质折叠过程的占22%,参与对氧化应激反应过程的占16%,参与糖酵解过程的占16%。说明木薯种茎的劣变是由于结合功能的蛋白质、氧化还原清除活性氧自由基的蛋白质和催化某些酶活性的蛋白质的上调或下调表达所致。图2 木薯种茎差异表达蛋白质的功能归类分析结果从图3可以看出,木薯种茎差异蛋白质主要位于线粒体、叶绿体、溶质、细胞质、膜的整体组成部分、细胞壁、胞液和分泌蛋白质上,SC8种茎和NZ199种茎中分别有47%、33%的差异蛋白质分布在其他位置。说明种茎发生老化劣变时,差异蛋白质分布多样化,这有利于各类生理功能的发挥。图3 木薯种茎差异表达蛋白质的亚细胞定位分析结果3 结论与讨论营养缺乏、激素代谢紊乱、高温、菌类感染等多种因素会导致植物细胞内活性氧(ROS)浓度的增加,形成氧化胁迫[20]。对木薯种茎来说,高温胁迫可导致种茎ROS浓度增加,最终导致种茎发生劣变。劣变的种茎细胞内由于ROS积累形成二硫键,导致D–3–磷酸甘油酸脱氢酶的下调表达[21];劣变的种茎防御能力下降,其大分子物质变性,合成酶活性下降,生理活性物质被破坏与失衡。刘兴晖等[22]的研究结果表明,壳三糖苷酶与防御能力呈正相关。苹果酸酶的催化产物能够促进多种抗逆物质的合成;肉桂醇脱氢酶与植物木质素生物合成有关,木质素可阻止各种病原菌的侵入,增强植物环境胁迫的应对能力[23]。D–3–磷酸甘油酸脱氢酶将3–磷酸甘油酸氧化为3–磷酸羟基***酸,形成合成蛋白质所需的丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸;1–脱氧–D–木***糖–5–磷酸还原异构酶蛋白可能影响赤霉素的合成[24]。说明上述酶下调表达与种茎细胞受到胁迫有关。种茎发生劣变时,自身修复的应激机制会即刻启动,以维持或恢复种茎活力。自身修复方式主要是抗衰老保护系统和去毒系统。GSTs参与细胞内的***分解过程和谷胱甘肽代谢过程,清除有毒化合物[25];类异黄***还原酶与植物中多种抗***的合成密切相关[26];防御相关蛋白质中病程相关蛋白在细胞内参与防御反应,抵御不良环境的影响[27–29];分子伴侣蛋白质中的热激蛋白HSP保护细胞膜和相关蛋白,以防种茎细胞脱水[30];CPN60蛋白与各种配体和细菌作用,参与抑制细胞凋亡[31–32],增强抗胁迫能力。种茎劣变时,种茎细胞上述差异蛋白质的上调表达有助于清除种茎细胞ROS,维持种茎的活力,这与前人的研究结论一致[33]。α–淀粉酶能促进催化淀粉水解成可溶性糖,为有氧呼吸提供原料;ATP合成酶β亚基的活性下降影响细胞内pH值和线粒体膜电位[34];烯醇化酶与呼吸作用密切相关,在细胞能量代谢过程中具有重要作用[35]。α–淀粉酶、ATP合成酶β亚基和烯醇化酶的上调表达为种茎自身修复的运转提供了能量,这也是种茎活力自身修复应激机制的一种表现。本试验中,SC8种茎α–淀粉酶上调表达,与陈晨等[33]的研究结果一致。NADP–ME上调表达可维持膜的流动性[36];APX的过量表达可提高植物的抗逆能力[37];PGK是糖酵解的关键酶,该酶的缺乏可引起生物体代谢等功能的紊乱;防御相关蛋白质中的脱水蛋白可清除细胞中的ROS,维持细胞膜的稳定性[38]。上述蛋白质上调表达有利于种茎活力的自身修复。本试验中,NADP–ME、APX和PGK均下调表达,这是否与这些蛋白对逆境较敏感有关,有待进一步研究。[1]张树河,李海明,李和平,[J].福建热作科技,2016,41(3):16–,LIHM,LIHP,[J].FujianScience&TechnologyofTropicalCrops,2016,41(3):16–18.[2][J].农家之友,2001(12):[J].FriendsofFarmers,2001(12):29.[3]刘斌,申章佑,甘秀芹,[J].南方农业学报,2013,44(12):1992–,SHENZY,GANXQ,[J].JournalofSouthernAgriculture,2013,44(12):1992–1996.[4]樊吴静,罗兴录,[J].中国农学通报,2012,28(33):65–,LUOXL,