〖医学〗基因工程实验[精].ppt

文档介绍：基因工程实验
实验五引物设计及PCR扩增靶基因
PCR引物设计
引物决定了PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件,如primer premier5、Oligo和北京军事医学科学院李伍举教授开发的Biosun等,免费引物设计网站有primer 3,Primerfinder等。
引物设计有以下几个原则:
(1)引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计,引物与非靶序列之间不要超过 70%的同源性或连续8个的碱基互补,减少非特异产物;
(2)引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分,不包括在5‘端额外增加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以18~24 bp为佳。
(3)引物3’末端的碱基。引物3’末端是延伸的始端,碱基错配会影响延伸效率。当最后一个碱基是A时,容易发生错配,所以引物3’末端最好不要为A;
(4)引物的G+C含量一般为40%~60%,过高或过低都不利于引发反应;
(5)两条引物不能形成稳定的二聚体,或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构,这些都会影响引物与模板的结合。
(6)两条引物的融解温度Tm值尽量不要相差太大,引物的Tm值粗略计算公式为Tm = 4 (G+C)+2(A+T);
(7)引物的5'端对扩增特异性没有影响,因此可以被修饰而不影响扩增的特异性,引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等,引物3'端是延伸的开始,不能进行任何修饰。
引物设计软件primer premier
在对话框中输入待扩增序列
点击左上角的“Primer”按钮
Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构
Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体
False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对
Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体
引物设计界面
正向和反向引物的互换
正向和反向引物的评价
正向和反向引物的信息
每点击左边红色的按钮,就出现相应的内容
对正向和反向引物进行编辑
可对引物进行增加或减少碱基
用键盘输入了5个碱基