文档介绍：转基因的方法和原理
1目的基因制备和载体系统
2几种有效的转基因方法
3定点突变和受体系统
简介
转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术,其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体,从而使该生物体具有表现某种性状。
转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。
转基因打破了物种的界限,使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起,并且完全可以按照人的意志或目的,实现对生物体的改造。
基本步骤
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,将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上;
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分离基因
克隆到某中间载体
转化大肠杆菌
提取质粒
限制酶切/连接
克隆到植物表达载体
转化农杆菌
基因枪转化
pKS,pBR332,pGEM-T
JM109, TOP10…
HindIII/EcroI… T4 ligase
pBI121, pCAM1001…
LBA4404, EHA
目的基因制备和载体系统
目的基因来源:基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。
载体:质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等
工具酶:限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等
PCR反应
PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。
PCR要求反应体系具有以下条件:
1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物(约20个碱基左右);
2、具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶;
3、4种dNTP;
4、作为模板的目的DNA序列。
PCR反应可扩增出100~5000bp的目的基因。
PCR反应过程
1、变性,即将模板DNA置于95℃的高温下,使双链DNA的双链解开变成单链DNA;
2、退火,将反应体系的温度降低至55℃左右,使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对;
3、延伸,将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72℃,然后以目的基因为模板,合成新的DNA链。
反复进行约30个循环左右,即可扩增得到目的DNA序列。
利用cDNA法
由于真核生物的mRNA具有poly A这一结构特点,可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子,根据碱基配对原则,将其吸附,从真核细胞的总RNA中提取出来,再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。
在mRNA群体中,有高丰度的mRNA,拷贝数多;也有低丰度的mRNA,但种类多,高丰度的mRNA容易合成cDNA。
要保证构建的cDNA文库中要含有目的克隆,可利用琼脂糖凝胶电泳、非变性蔗糖梯度离心和羟甲基蔗糖剃度离心等分级分离不同长度的mRNA,也可以利用cDNA的大小分级分离。