文档介绍：植物病原菌分离方法(综合版)
植物病原细菌分离方法:
分离培养基(NA)
植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法:
取灭菌研钵加无菌水适量,切去4 mm大小病块组织,经过表面消毒和无菌水冲洗3次后放入研钵中研碎,静置10-15 min,使组织中的细菌进入水中制成悬浮液;
配制不同稀释度的细菌悬浮液;
准备3-5个灭菌培养皿,每个加200 µl无菌水;
用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中,充分混匀后再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中,依次类推;
平板划线分离,28℃培养2-3天;
挑取单菌落划线再次纯化;
菌落形态观察:
形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等;
菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀
菌苔颜色也不同,质地有粘质的、膜质的或蜡质的。有透明的、半透明的或不透明的,表面有暗色或发亮的
菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征
注:
若分离成功,平板上菌落形态和大小比较一致,即使出现几种不同形状的菌落,终有一种是主要的;
如果菌落类型很多,且不分主次,很可能未分离到病原细菌,应考虑重新分离;
如果不熟悉一种细菌菌落的性状,就应选择几种不同类型的菌落,分别培养后接种测定其致病性,最终确定病原菌;
一种细菌病害一般由一种病原菌引起的,平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一种是真正的病原细菌;
腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的,但也有一种是主要的。
各种植物病原细菌生长快慢不同:
假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天
土壤杆菌属细菌2-3天
黄单胞菌属细菌3-4天
棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落
植物病原细菌生长量测定法
直接法
测体积
粗放的方法,将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心,然后观察沉降物的体积。
称干重
采用离心法或过滤法测定,一般干重为湿重的10%~20%。
离心法(细菌)
将待测培养液离心,再用清水洗涤离心1~5次后干燥,可用105℃、
100℃或红外线烘干,或在较低的温度(80℃或40℃)下进行真空干燥,然后称干重。
如细菌一个细胞一般重10-12~10-13g。
过滤法
丝状真菌用滤纸过滤,细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤。
过滤后,细胞可用少量水洗涤,再真空干燥(40℃以下),称干重。
间接法
生理指标法
与生长量相平行的生理指标很多,它们均可用作生长测定的相对值。
测细胞总含氮量
%,%,%
含氮量的测定方法有很多,常用凯氏定氮法。
含碳量的测定
微生物新陈代谢的结果,必然要消耗或产生一定量的物质,以表示微生物的生长量。
一般生长旺盛时消耗的物质就多,或者积累的某种代谢产物也多。
将少量生物材料混入1ml水或无机缓冲液中,用2ml 2%***钾溶液在100℃下加热30分钟,冷却后,加水稀释至5ml,在580nm波长下测定光密度值推算出生长量。
其它
磷、DNA、RNA、ATP和 N–乙酰胞壁酸等的含量,以及产酸、产气、产CO2(用标记葡萄糖作基质)、耗氧、粘度和产热等指标,均可用于生长量的测定。
比浊法
微生物在液体培养基中生长,由于