1 / 8
文档名称:

一种大麦脂肪氧化酶(lox-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法.docx

格式:docx   大小:19KB   页数:8页
下载后只包含 1 个 DOCX 格式的文档,没有任何的图纸或源代码,查看文件列表

如果您已付费下载过本站文档,您可以点这里二次下载

分享

预览

一种大麦脂肪氧化酶(lox-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法.docx

上传人:421989820 2024/5/8 文件大小:19 KB

下载得到文件列表

一种大麦脂肪氧化酶(lox-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法.docx

相关文档

文档介绍

文档介绍:该【一种大麦脂肪氧化酶(lox-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法 】是由【421989820】上传分享,文档一共【8】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一种大麦脂肪氧化酶(lox-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种大麦脂肪氧化酶(lox-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法专利名称:一种大麦脂肪氧化酶(lox-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法技术领域:本发明涉及一种大麦脂肪氧化酶(L0X-1)合成缺陷的基因变异及其应用。背景技术:以脂肪氧化酶(Lipoxygenase,L0X)为核心的脂质降解途径是影响以大麦为主要原料的诸如啤酒等饮料的风味的一项重要因素,同时,也是导致谷物储藏期间品质变劣、产生陈味的根源。在啤酒工业中,反式-2-壬烯醛(T2N)是由脂质降解产生的一种典型的风味老化物质,被认为是啤酒老化的指示剂,严重影响啤酒长期储存的商品性(刘明丽等2011,酿酒科技5:98-102)。在脂质降解途径中,脂肪氧化酶分别将亚油酸转化为9-氢过氧化十八碳二烯酸(9-HP0D)和13-氢过氧化十八碳二烯酸(13-HP0D)的双加氧作用。在酿酒工业中,9-HP0D为主要的脂肪氧化酶通路代谢产物,通过进一步酶促或自发反应导致反式-2-壬烯醛(T2N)的产生(Kuroda等2003,BiosciBiotechnolBiochem67:691-697)。在谷物储藏过程中,脂肪氧化酶促进氧元素与多链不饱和脂肪酸结合,形成双链的氢过氧化物,进一步转变成一些挥发性的醛、***类气体化合物,从而导致谷物变质和变味;缺失脂肪氧化酶的稻米与未缺失的品种相比耐储藏性更好,同时品质、发芽率更高,虫害率更低(Zhang等2007,JournalofStoredProductsResearch43:87-91)。目前,大麦中已知有3个脂肪氧化酶基因(Lox-1或LoxA,Lox_2或LoxC以及Lox_3或LoxB)(VanMechelen等1999,(6):1283-1298),其中Lox-1是影响大麦麦芽脂肪氧化酶活性的主要基因(Kuroda等2005,ongress,750-756)。已有报道称,经通过人工诱变获得的L0X-1基因失活的变异(US20030167544A1),此外还有筛选种质资源发掘到的自然变异(Hirota等2005,,111:1580-1584),并随即用于高品质啤酒大麦新品种的选育。研究表明,这些L0X-1基因失活的大麦原料均可显著降低啤酒中T2N的含量,经过长时间储存也不会显著增加,从而保证啤酒风味不发生改变(US20090285932A1)。目前丹麦嘉士伯啤酒公司以及日本札幌啤酒有限公司已分别经过人工化学诱变以及筛选自然的L0X-1基因合成缺陷型突变体,并对相关基因变异申请了专利保护。发明内容针对上述现有技术的缺点,本发明从中国大麦品种中发掘出的L0X-1合成缺陷型自然变异,位于第二内含子中,与其他已有报道的变异位点均不属于同一位点,为新的基因变异类型,且已同步开发出特异的功能性分子标记用于辅助快速育种。为实现本发明的目的,从大麦种质资源中筛选获得脂肪氧化酶活性缺失的自然变异材料,进一步获得L0X-1基因突变位点,并开发相应的单核苷酸多态性分子标记(SNPMarker)。具体地说,对1000份原产于我国的大麦种质资源进行磨粉和酶液粗提,并用化学显色的方法进行L0X-1活性鉴定,最终筛选出L0X-1活性缺失的自然变异材料。根据已经报道的L0X-1基因序列,设计基因特异性引物,对自然变异和活性正常材料的基因组DNA进行PCR扩增和克隆测序,最终确定导致LOX-1活性缺失的突变位点;同时,从发芽后的大麦组织中提取mRNA,反转录为cDNA,对上述功能突变材料的L0X-1基因进行测序,并将筛选出的目的基因进行序列比对和功能缺失原因分析。进一步开发出改功能位点的多态性分子标记,实验验证该分子标记用于辅助育种的可靠性和有效性。大麦粗提蛋白的脂肪氧化酶活性分析结果显示,第二内含子中642bp处的单个碱基突变(G型)的大麦种质资源L0X-1活性缺失,而对照的正常的野生型(C型)则表现为活性正常,说明这是进行L0X-1活性缺失大麦新品种选育的新的基因资源。此外,本发明通过开发该SNP位点的特异性分析标记,可用于分子标记辅助育种。采用L0X-1活性缺失的啤酒大麦原料,能够使酿酒者生产出即使经长期储藏,T2N特异性的陈腐异味水平也不明显增加的啤酒;并能够辅助培育耐储藏的高品质食用大麦(青稞)和饲用大麦新品种。图1为L0X-1活性缺失材料的筛选示意2为大麦脂肪氧化酶基因L0X-1的基因结构及其功能变异位点样品I4为大麦L0X-1活性缺失型大麦品种(G型);5_8为活性正常大麦品种(C型)图3为Loxl基因组第二内含子单碱基变异导致内含子剪切位点改变示意4为Loxl基因第二内含子剪切位点改变导致所编码蛋白变异的示意图样品1-3(G型)的Lox-1基因由于发生移码突变和提前终止,导致编码L0X-1蛋白失活;样品4(G型)的Lox-1基因由于发生提前终止,导致编码L0X-1蛋白失活;样品5_8(C型)的Lox-1基因可编码有活性的L0X-1蛋白;图5为Lox-1基因SNP特异性分子标记检测不同大麦样品的电泳图谱M:分子量标准(2000bpLadder);样品I4为大麦Loxl基因的突变型大麦品种(G型),其PCR产物()为720bp;样品5_8为没有突变的野生型大麦品种(C型),其PCR产物(RNF/)为320bp;样品9-12为杂交种(Fl型),其PCR产物两条电泳谱带均有。具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。-,用涡旋震荡器混合均匀后,3000rpm离心2min,取50ul上清至另一2ml的离心管中;(10ml20mmDMAB/100mm磷酸缓冲液,,现用现配,避光保存),反应20分钟,(,,,现用现配,避光保存)反应10分钟,%的SDS终止反应。如果离心管中呈深蓝色,表明L0X-1活性正常,如果呈现浅蓝或者无色,表明L0X-1活性低或者无活性。最终筛选到4份L0X-1活性缺失的大麦种质。-,液氮速冻研磨后采用标准CTAB法进行大麦DNA提取,经RNA酶纯化后定量稀释为50ng/ul的工作液;根据NCBI数据库中的Lox-1基因组序列(GenBank:),采用Primer3在线引物设计服务器,设计覆盖整个基因编码区的PCR引物(表I),并采用ABI3900基因合成仪合成相应寡核苷酸探针。以上述提取的DNA工作液为模板,利用Taq聚合酶对这些大麦材料的Lox-1基因进行PCR扩增和克隆测序。PCR扩增反应的条件为95°C3min,(95°C20s,58°C20s,72°C2min)共35个循环,72°C延伸7min后终止反应。(LOX-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法,其特征在于包括以下步骤:对大麦种质资源进行磨粉和酶液粗提,并用化学显色的方法进行L0X-1活性鉴定,筛选出L0X-1活性缺失的自然变异材料,设计基因特异性引物,对自然变异和活性正常材料的基因组DNA进行PCR扩增和克隆测序,最终确定导致L0X-1活性缺失的突变位点;同时,从发芽后的大麦组织中提取mRNA,反转录为cDNA,对上述功能突变材料的L0X-1基因进行测序,并将筛选出的目的基因进行序列比对和功能缺失原因分析,进一步开发出改功能位点的多态性分子标记,其中基因组DNA测序引物为:::RNFAAAACATAACTTTTTAATAGTAATGTTGCAC。(LOX-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法,其特征在于:所述的化学显色方法为:称取大麦粉溶蒸馏水中,混合均匀后离心,取上清至另一离心管中;向离心管中一次加A溶液,反应20分钟,再加入的B溶液反应10分钟,最后用SDS终止反应,如果离心管中呈深蓝色,表明LOX-1活性正常,如果呈现浅蓝或者无色,表明LOX-1活性低或者无活性,其中反应溶液A:10ml20mmDMAB/100mm磷酸缓冲液,;反应溶液B:,,。(L0X-1)合成缺陷基因的多态性分子标记方法,其特征在于:区分纯合和杂合突变位点,能够用于优质新品种选育的分子标记辅助选择,实现分子标记辅助进行大麦品质改良的育种目标上的应用。全文摘要本发明为一种大麦种资资源的分子标记方法,属于植物分子育种领域。大麦种质资源进行磨粉和酶液粗提,并用化学显色的方法进行LOX-1活性鉴定,最终筛选出LOX-1活性缺失的自然变异材料。根据已经报道的LOX-1基因序列,设计基因特异性引物,对自然变异和活性正常材料的基因组DNA进行PCR扩增利克隆测序,最终确定导致LOX-1活性缺失的突变位点;同时,从发芽后的大麦组织中提取mRNA,反转录为cDNA,对上述功能突变材料的LOX-1基因进行测序,并将筛选出的目的基因进行序列比对和功能缺失原因分析,进一步开发出改功能位点的多态性分子标记,实验验证该分子标记用于辅助育种的可靠性和有效性。