1 / 19
文档名称:

一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法.docx

格式:docx   大小:29KB   页数:19页
下载后只包含 1 个 DOCX 格式的文档,没有任何的图纸或源代码,查看文件列表

如果您已付费下载过本站文档,您可以点这里二次下载

分享

预览

一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法.docx

上传人:开心果 2024/5/8 文件大小:29 KB

下载得到文件列表

一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法.docx

相关文档

文档介绍

文档介绍:该【一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法 】是由【开心果】上传分享,文档一共【19】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用的制作方法本发明涉及一种具有抑制BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖及其应用,一株具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9,该菌株于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,?。本发明还提供黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖中的应用。本发明所述黑根霉(Rhizopus?nigricans)RN-9具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的功能。【专利说明】一种具有抗癌活性的黑根霉多糖及其应用【技术领域】[0001]本发明涉及一种具有抑制BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖及其应用,属于生物医药【技术领域】。【背景技术】[0002]随着世界总人口持续增长和人口老龄化的加剧,以及逐年增多的患癌高危行为,使得全球癌症患者数量急剧增加。据美国癌症协会(ACS)统计数据显示,2008年全球约有760万癌症患者死亡,其中胃癌死亡病例达74万,中国每年约有23万人死于胃癌。不合理饮食和幽门螺旋杆菌感染是导致胃癌的重要原因。在我国山东省临朐县、辽宁省庄河县、福建省长乐县最具代表性的胃癌高发地区。[0003]大部分胃癌患者在确诊时已处于晚期阶段并往往伴发多种疾病,使得胃癌的治愈尤为困难。手术合并化学疗法是胃癌治疗的主要手段,但是化疗药物会导致严重的副作用,迫切需要寻找高效、低毒的新型肿瘤治疗药物。[0004]多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接形成的含醛基或***基的多羟基聚合物及其衍生物。天然功能性多糖作为一类重要的生物活性物质,具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗氧化等多种功能。天然活性多糖的细胞毒性小、免疫原性极低、安全性高,是开发癌症治疗药物的重要来源。目前,已有多种抗肿瘤辅助多糖药物作为辅助治疗肿瘤的药物在临床应用,如香菇多糖、云芝多糖等。[0005]1969年Chiharals首次发表关于真菌多糖的抗肿瘤的研究结果后,多种具有免疫调节、抗肿瘤等活性的多糖被陆续发现。多糖是重要的生物效应调节剂(BiologicalResponseModifier,BRM),主要通过激活机体的淋巴细胞,提高免疫系统响应能力,间接的发挥抗肿瘤作用。然而越来越多的研究发现,一些真菌多糖可以在体外直接抑制肿瘤细胞增殖,甚至杀死肿瘤细胞。这些多糖通过引起细胞应激,调控肿瘤细胞中信号分子的表达,改变细胞膜特性,诱导细胞凋亡、周期阻滞和自噬。[0006]多糖对肿瘤细胞有广泛的影响,若干多糖通过改变肿瘤细胞膜的生化特性来杀死肿瘤细胞,此作用主要与唾液酸与磷脂转换有关。唾液酸主要位于细胞表面糖蛋白和糖脂的聚糖链末端。唾液酸增多可影响细胞表面电荷特性、抗原决定簇的暴露、膜的物质转运过程、膜表面受体功能等。茯苓多糖作用于S180和K562细胞后,可升高肿瘤细胞膜上的唾液酸含量,干扰细胞膜的肌醇磷脂代谢和磷脂酰肌醇转换,抑制细胞生长。虎奶菇菌核中分离出的水溶性羧***葡聚糖CMPTR可以降低乳腺癌MCF-7细胞中抗凋亡蛋白Bcl_2的表达,增高促凋亡蛋白Bax的表达,促进细胞凋亡。黄涛涛等研究发现,拟康氏木霉胞外多糖EPS体外处理白血病K562细胞后,诱导K562细胞染色质聚缩,磷脂酰丝氨酸的外翻,线粒体膜电位下降,细胞内活性氧及游离钙离子浓度的提高,表明EPS可能通过线粒体途径诱导K562细胞发生凋亡。真菌多糖的抗肿瘤作用是可靠的、普遍的,开发治疗或辅助治疗肿瘤的天然药物具有坚实的基础。[0007]天然多糖几乎不可合成,而目前临床使用的或正在研究的多数多糖药物都受资源限制,开发成本高昂。真菌多糖优势在于活性高、生产周期短,不受季节、气温等条件限制,且产量高、纯化简单,所以真菌多糖具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。(Rhizopusnigricans)是从秸杆中分离获得,属于真菌门接合菌亚门的根霉属,具有极强的生长势。黑根霉是目前发酵工业中常用的微生物菌种,被广泛应用于食品医药行业,如生物转化和有机酸的生产等。通过液体深层发酵技术,可以生产大量的黑根霉菌丝。黑根霉菌丝中含有丰富的多糖,可以从中分离具有潜在抗肿瘤作用的活性多糖,进行临床前研究。【发明内容】[0008]本发明针对现有技术的不足,提供一种具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖及其应用。[0009]术语说明[0010]seveage试剂:一种蛋白质变性剂,可以使蛋白质变性从溶液中析出。[0011]本发明的技术方案如下:[0012]一株具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9,该菌株于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所,。[0013]上述黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖中的应用。[0014]上述应用,步骤如下:[0015](I)(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA(马铃薯蔗糖)培养基中活化24小时,制得活化菌丝;[0016](2)将步骤(1)制得的活化菌丝转接于马铃薯蔗糖液体培养基中,培养温度为27~29°C,120rpm,培养10天,4层纱布过滤,制得液体发酵菌丝;[0017](3)将步骤(2)制得的液体发酵菌丝在75°C下,经95%的乙醇回流脱脂8小时;[0018](4)将步骤(3)制得的脱脂菌丝通过热水浸提获取热水提取液,60°C减压浓缩至原体积的20%-30%,然后向冷却至室温的浓缩液中加入三倍体积的体积百分比为95%的乙醇溶液,4°C过夜,离心,收集沉淀;[0019](5)将步骤(4)收集的沉淀用去离子水溶解,然后加入1/3体积的seveage试剂,剧烈振荡脱去蛋白质,制得粗糖溶液;[0020](6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过弱碱性阴离子交换树脂D-301R脱色后,采用DEAE-FastFlow阴离子交换凝胶和S印hacrylS-500HR凝胶分离纯化,制得黑根霉菌丝多糖(RPS)溶液;[0021](7)将步骤(6)制得的黑根霉菌丝多糖溶液经真空冷冻干燥后,制得黑根霉菌丝多糖。[0022]所述步骤(1)中活化的时间为20~26h,活化温度为25°C~30°C。[0023]所述步骤(3)中的脱脂温度为75°C,时间为8小时。[0024]所述步骤(4)中的离心条件为:1000Orpm离心5min。[0025]所述步骤(5)的seveage试剂由***仿与正丁醇按体积比4:1的比例混合。[0026]上述黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的药物中的应用。[0027]有益效果[0028]1、本发明所述黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的功能,该多糖可以在体外激活线粒体凋亡通路诱导BGC-823细胞发生凋亡,从而抑制BGC-823细胞生长;体内给药可以增加荷瘤小鼠体重,减小肿瘤体积和重量,抑制肿瘤生长,因而该多糖可应用于制备抗肿瘤药物或辅助药物。[0029]2、本发明所述黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9具有较高的产黑根霉菌丝多糖的能力,按常规方式发酵培养,产率可达到50mg/L。【专利附图】【附图说明】[0030]图1A黑根霉菌丝多糖高效凝胶渗透色谱分析;[0031]图1B单糖标准品的高效液相色谱图;[0032]图1C黑根霉菌丝多糖单糖组成分析;[0033]图2黑根霉菌丝多糖体外给药对胃癌BGC-823细胞体外增殖活性影响的柱状图;[0034]图3黑根霉菌丝多糖体外给药诱导胃癌BGC-823细胞发生凋亡的影响结果;[0035]图4黑根霉菌丝多糖体外给药对胃癌BGC-823细胞线粒体膜电位的影响;[0036]图5黑根霉菌丝多糖体外给药对胃癌BGC-823细胞Caspase-3和Caspase-9活力影响的柱状图;[0037]图6A黑根霉菌丝多糖体外给药提高自噬性死亡的BGC-823细胞比例;[0038]图6B黑根霉菌丝多糖体外给药提高BGC-823细胞内酸性囊泡数量;[0039]其中:*表示t检验后,与对照组相比呈显著性差异(P()[0040]**表示t检验后,与对照组相比呈极显著性差异(P≤)【具体实施方式】[0041]下面结合实施例对本发明做进一步阐述,但本发明所保护范围不限于此。[0042]试剂说明[0043]DEAE-FastFlow阴离子交换凝胶、SephadexG-100凝胶购自GE公司;[0044]弱碱性阴尚子交换树脂D-301R购自天津南大树脂有限公司;[0045]MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)_2,5-diphenyltetrazoIiumbromide)、结晶紫、吖啶橙购自Sigma-Aldrich公司;Hoechst33258染色液、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、活性氧检测试剂盒、韩离子检测试剂盒、Caspase-3,9活性检测试剂盒、细胞裂解液购自碧云天生物技术有限公司;[0046]胃癌BGC-823细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;[0047]其他试剂均为本领域常用市售试剂,分析纯。[0048]实施例1[0049]一株具有产抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖的黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9,该菌株于2013年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所,。[0050]菌株特征:匍匐菌丝,臌根发达,分枝多,褐色,两节间距离I~3毫米;孢子囊球形或椭圆形,褐色,直径65—350微米,膜上有小结晶,易消融;囊轴球形、椭圆形、卵形或不规则,膜薄平滑,淡褐色,直径约70微米,高约90微米;中轴基存在,直径25~214微米;孢子形状不对称,近球形、卵形或多角形,表面有线纹,呈蜜枣状,褐色,~~8微米;接合孢子球形、卵形,外膜刚硬,黑色,有瘤状突起,直径160~220微米;无厚垣孢子[0051]实施例2[0052]实施例1所述黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-9在制备具有抑制胃癌BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖中的应用,步骤如下:[0053](1)(Rhizopusnigricans)RN-9接种于PDA培养基中,在28°C条件下活化24h,制得活化菌丝;[0054]所述PDA培养基,每升组分如下:马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂2g,自来水定容至1000mL,自然pH;[0055](2)将步骤(1)制得的活化菌丝转接于PDB发酵培养基中,培养温度28±1°C,120rpm摇床培养10天,4层纱布过滤,制得液体发酵菌丝;[0056]所述马铃薯蔗糖液体培养基,每升组分如下:马铃薯200g,蔗糖20g,自来水定容至1000mL,自然pH;[0057](3)将步骤⑵制得的菌丝,经95%乙醇(体积浓度)、75°C回流脱脂8小时,[0058](4)将步骤(3)制得的脱脂菌丝通过100°C热水浸提,获取热水提取液,然后60°C减压浓缩至原体积的25%。向冷却至室温的浓缩液中加入三倍体积的95%乙醇(体积浓度),4°C过夜,1000Orpm离心5min,收集沉淀;[0059](5)将步骤(4)收集的沉淀用去离子水溶解,得溶解液,然后加入溶解液体积1/3的seveage试剂剧烈振荡脱去蛋白质,seveage试剂由***仿与正丁醇按体积比4:1的比例混合制得,制得粗糖溶液;[0060](6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过弱碱性阴离子交换树脂D-301R脱色后,采用DEAE-FastFlow阴离子交换凝胶和S印hacrylS-500HR凝胶分离纯化,制得黑根霉菌丝多糖溶液;[0061](7)将步骤(6)制得的黑根霉菌丝多糖溶液经真空冷冻干燥后,制得具有抑制BGC-823细胞生长活性的黑根霉菌丝多糖(RPS)。[0062]经上述方法制得的RPS为白色固态,呈絮状;[0063]经红外光谱检测,发现其有多糖的特征峰吸收,证明RPS为多糖;[0064]碘-碘化钾反应、双缩脲反应、紫外吸收检测结果表明RPS中不含淀粉、蛋白质、核酸杂质;[0065],单糖组成为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、鼠李糖,:::::(如图1A,B,C所示)ο[0066]实施例3