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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。:..:增强免疫力功能评价方法(征求意见稿)保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items,:胸腺/体重比值,脾脏/:小鼠脾淋巴细胞转化实验,:抗体生成细胞检测,—巨噬细胞功能测定:小鼠碳廓清实验,,,受试样品具有增强免疫力作用。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性四个方面测定中,任两个方面试验结果为阳性,可以判定该受试样品具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性,判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性,判定体液免疫功能试验结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性,判定单核一巨噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性,判定NK细胞活性结果阳性。正常动物实验需进行四个方面的测定。采用免疫功能低下动物实验,受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。在免疫功能低下模型成立条件下,血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性五个方面测定中,任两个方面试验结果为阳性,判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性,或任一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性,或任一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定体液免疫功能试验结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性,或任一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定单核—巨噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性,可以判定NK细胞活性结果阳性。血液白细胞总数测定的二个以上剂量结果阳性,可以判定血液白细胞总数结果阳性。免疫功能低下模型动物实验至少需进行三个方面的测定。同时在各项实验中,任何一项测试都不出现加重免疫抑制剂作用的结果。:..:免疫系统主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴组织和全身各处的淋巴细胞、抗原呈递细胞等,还包括血液中的白细胞。淋巴细胞经血液和淋巴使各处的淋巴器官和淋巴组织连成一个功能整体。胸腺属中央淋巴器官,主要功能是确保T淋巴细胞的产生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性细胞;脾脏对抗原发生免疫应答作用,脾窦的巨噬细胞具有清除功能,脾白髓含有记忆B细胞,产生对T依赖抗原的体液免疫应答。淋巴细胞是特异性免疫应答的主要细胞群,按其表面标志物,分为T细胞、B细胞和天然杀伤细胞(NK三大类,T细胞又分为CD4(Th)细胞和CD8淋巴细胞。B淋巴细胞转化为浆细胞后能合成和释放抗原特异抗体,所有抗体都是免疫球蛋白,但并非所有的免疫球蛋白分子都具有抗体功能。免疫系统可产生特异性免疫和非特异性免疫功能,检测上述免疫系统的各种代表性指标的改变可对增强免疫力作用的功能做出相应判定。,如C57BL/6J、BALB/C等,6?8周龄,18?22g(BALB/C种可16-18g),单一性别,雌雄均可,每组10?15只。。以人体推荐量的10倍为其中一个剂量,另设二个剂量组。必要时设阳性对照组。选做免疫低下模型法时,应设模型对照组。受试样品给予时间四周或30天。***、氢化可的松或其他合适的免疫抑制剂进行药物造模。造模原理:***主要通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性地杀伤淋巴细胞,并可抑制淋巴细胞转化;环磷酰***对B细胞的抑制比T细胞强,一般对体液免疫有很强的抑制作用,对NK细胞的抑制作用较弱。,阻碍NF-B进入细胞核,抑制细胞因子与炎症介质的合成和释放,达到免疫抑制目的。氢化可的松还可损伤浆细胞,抑制巨噬细胞对抗原的吞噬、处理、和呈递作用,所以氢化可的松对细胞免疫、体:..液免疫和巨噬细胞的吞噬、作用都有一定的抑制作用。免疫抑制剂剂量选择环磷酰***可选择40mgkg,腹腔注射,连续两天,末次注射给药后第5天测定各项指标;氢化可的松可选择40mg/kg,肌内注射,隔天一次,共5次,末次注射给药后次日测定各项指标。各指标对两种模型敏感性不同,环磷酰***模型比较适合抗体生成细胞检测、血清溶血素测定、白细胞总数测定;氢化可的松模型比较适合迟发型变态反应、碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验、NK细胞活性测定,建议根据不同的免疫功能指标选择合适的模型。受试物给予连续给予受试物4周或30天,在第3周后开始给予免疫抑制剂,进行模型与预防性给药相结合的实验。(仪器法)全血用EDTAK抗凝后经血细胞分析仪检测,可测定白细胞数量,并可对白细胞进行分分2类计数。***四乙酸二钾(EDTA&-2H0,),离心管,全血细胞分析仪上样管,眼科镊子,振荡器,加样枪,冷冻离心机,全血细胞分析仪。:EDTA&能与血液中的钙离子结合成为螯合物,从而阻止血液凝固,?的EDTAK可阻止1ml血液凝固。28mgEDTAK100ml50^1抗凝剂配制:称量加纯净水至制成抗凝剂,抗凝剂可抗凝21ml小鼠全血。:..以摘除小鼠眼球的方法采集全血,采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球,让血液自由滴入装有抗凝剂的离心管(或商品化的抗凝管)中,采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固,每只动物采集抗凝全血约。,注意检查是否存在凝块。在24h内以全血细胞分析仪检测白细胞总数和淋巴细胞数。上机操作参照仪器说明书。,按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,p>,结论:各组均数间差异无显着性意义;F值》,P用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐性要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。受试样品组的白细胞总数显着高于阴性对照组,可判定该项实验结果阳性。,活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT—种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色结晶而显色,其光密度值能反映细胞的增殖情况。-2-ME)细胞培养液、小牛血清、巯基乙醇(、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA、盐酸、异丙醇、MTTHank's液、PBS缓冲液()纱布、200目筛网、24孔培养板,96孔培养板(平底),手术器械、大号注射器内芯、二氧化碳培养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。,用前加入10%小牛血清,1%谷氨酰***200mmol/L100U/mL100ug/L5X105mol/L的2-巯基乙醇,(),青霉素(,链霉素()及一1mol/LHCI1mol/LNaOHMpH用无菌的的或的至,即完全培养液。:..100ug/mL-20液用双蒸水配制成的溶液,过滤除菌,在低温冰箱(保存。Hank'无菌液用前以%的无菌。MTT液将5mgMT溶于1mL的PBS中,现配现用。酸性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mL1mol/L的HCl,临用前配制。,置于盛有适量(3-5ml)无菌Hank's液平皿中,并在脾上面放置一块纱布,用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎,制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤,用Hank's液洗2次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中,用全自动细胞计数仪计数脾细胞,或用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%^上),调整细胞浓度为3X106/mL个。,每孔1mL,—孔加75卩lConA液(相当于卩g/O72h4h),另一孔作为对照,置%,孵箱中培养。培养结束前,每孔轻轻吸RPMI1640MTT(5mg/mL50l/L,去上清液,加入不含小牛血清的培养液,同时加入卩孑继续培养4h。培养结束后,每孔加入1mL酸性异丙醇,超声震荡(2秒)或人工吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔分装3孔作为平行样,用酶联免疫检测仪,以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中,分光光度计上在波长570nm测定OD值。,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<,结论:各组均数间差异无显着性;F值》,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力,受试样品组的光密度差值显着高于对照组的光密度差值,可判定该项实验结果阳性。,浓度过低不能刺激足够的细胞增殖,浓度过高会抑制细胞增殖,不同批号的ConA在实验前要预试,以找到最佳浓度。:..,且溶解甲臜的有机溶剂有毒性,可选择XTT法替代MTT法。其原理是:XTT是二甲氧唑黄,在电子耦合试剂存在的情况下,活细胞线粒体中的脱氢酶可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的甲臜,生成的甲臜能够溶解在组织培养基中,不形成颗粒,可直接用酶联免疫检测仪检测定吸光值。;5107100^196淋巴细胞增殖反应:调整细胞浓度为,取细胞悬液分别加入孔培养板510lConA237C5CO中,一孔加?卩液,另一孔作为对照,设个平行孔,置%饱和湿度72h4h,2050^1XTT孵箱中培养。培养结束前向各孔中加入?的工作液(按试剂盒说明现用现配),孵育4小时。用酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度。,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<,结论:各组均数间差异无显着性;F值》,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力,受试样品组的光密度差值显着高于对照组的光密度差值,可判定该项实验结果阳性。,以找到最佳效果。-ELISA法),BrdU可竞争掺入到增殖细胞中新合成的DNA链内,将BrdU标记的细胞作为抗原结合到固相载体表面,加入酶连接的抗-BrdU抗体,使BrdU抗原与酶标抗体充分结合,抗原抗体复合物与底物作用后产生有色物质,其光密度可反映细胞增殖的程度。,全自动酶标仪、超净工作台、二氧化碳培养箱、96孔培养板:..(平底)、倒置显微镜、移液器、手术器械、目筛网、细胞活性分析仪;RPMI1640细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA、Hank's液、PBS缓冲液()、BrdU细胞增殖检测试剂盒(ELISA)、纯净水、终止液。,用前加入10%小牛血清,1%谷氨酰***200mmol/L100U/mL100g/L5105mol/L的2-巯基乙(),青霉素(),链霉素(卩、及一醇,用无菌的1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH调pH至,即完全培养液。ConA100ug/mL-20C液用双蒸水配制成的溶液,过滤除菌,在低温冰箱(保存。无菌Hank's液用前以%的无菌NaHCO调。BrdU标记液将标记剂(试剂盒)按1:100的比例加到培养液中混匀,现配现用Anti-BrdU-POD-20C抗体贮存液(母液)在(试剂盒)中加双蒸水充分混合,存于备用。100110ml抗体工作液每卩抗体母液加抗体稀释液(试剂盒),现配现用。洗液每10ml清洗缓冲液(试剂盒)加100ml双蒸水。,置于盛有适量无菌Hank's液平皿中,并在脾上面放置一块纱布,用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎,制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤,用Hank's液洗2次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中,用全自动细胞计数仪计数952X107/mL脾细胞,或用台酚兰染色计数活细胞数(应在鸠上),调整细胞浓度为个。^1/2L,19011640将细胞加入孔培养板中,孔,每份细胞加孑第孔再加入卩培285^116401ConA31001养液,第孔加入培养液和卩同时设个空白孔,每孔仅加卩16405%CO37C72h4hBrdU10^1/培养液,置培养箱孵育,培养结束前加入标记液,孑L,1000r/min,10min,4C培养结束后离心()弃上清,吹干细胞,放冰箱保存待测。^130min,100^1BrdU每孔加固定液,常温放置后吸弃固定液。加入抗体工作37C60min250^13液,孵育;吸弃未结合的抗体,力卩洗液洗次,轻拍移去洗液。加底物:../L,15min溶液(含孑常温孵育。用酶标仪测量吸光值,不加终止液时,测定发射波长为370nm(记为阳。),参考波长492nm(记为A);加终止液时,测定发射波长为450nm(记为忑。),参考波长690nm(记为492A)。(LI),LI=(A-A)-(A-A)或LI=(A-A370空白370492空白492450)-(-A)。用加ConA孔的LI值减去不加ConA孔的LI值所得的差值代表空白450A390空白690淋巴细胞的增殖程度。采用方差分析对标记指数差值进行统计学分析,按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<,则各组均数间差异无显着性;F值》,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。受试样品组的LI值差值显着高于对照组的LI值差值,可判定该项实验结果阳性。,ConA的浓度过高会产生抑制作用,不同批号的ConA在实验前要预试,以找到最佳刺激分裂浓度。迟发型变态反应(DTH)迟发型变态反应是细胞免疫的体内检测法,当致敏T细胞再次与抗原接触,引起T细胞活化,释放出多种细胞因子,致局部组织发生以单核细胞为主的炎症反应,一般在24?48h达高峰。可任选下列方法之一试验。531二硝基***苯诱导小鼠DTH耳肿胀法)***苯(DNFB稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原,由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4?7d后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击,使局部肿胀,一般在抗原攻击后24?48h达高峰,其肿胀程度可以反映迟发型变态反应程度。、***、麻油、硫化钡、打孔器。,称取DNFB50mg置清洁干燥小瓶中,将预先配好:..的***麻油溶液(***:麻油=1:1),倒入小瓶,盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后,用250注射器通过瓶盖取用。531323cmX3cmDNFB50^1致敏每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛,范围约用溶液均匀涂抹致敏。53133DTH5DNFB101的产生与测定天后,用溶液卩均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠,剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片,称重。,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<,结论:各组均数间差异无显着性;F值》,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显着高于与对照组的重量差值,可判定该项实验结果阳性。:操作时应避免DNFBW皮肤接触。(SRBC诱导小鼠DTH足跖增厚法),4天后,当再以SRBC攻击时,攻击部位出现肿胀,其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。(、SRBC微量注射器(50卩I)、足趾容积测量仪。(v/v)SRBC1X108致敏小鼠用%腹腔或静脉免疫,每只鼠注射(约个SRBC、。,测量左后足跖部厚度或肿胀度,然后在测量部位20(v/v)SRBC20l1X108SRBC24h皮下注射%,每只鼠卩(约个,注射后于测量左后足跖部厚度或肿胀度,同一部位测量三次,取平均值。测量方法:用游标卡尺测量肉眼读数。或用足趾容积测量仪进行测量足跖部肿胀度,操作:..方法按仪器操作指引进行。数据处理和结果判定般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<,结论:各组均数间差异无显着性;F值》,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。以攻击前后足跖厚度或肿胀度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显着高于对照组的差值,可判定该项实验结果阳性。,最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部,但不要加压,否则会影响测量结果。攻击时所用的SRB(要新鲜(保存期不超过1周)。抗体生成细胞检测(改良法)、IgG等抗体分泌细胞数体外试验法。用绵羊红细胞(SRBC免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC昆合,在补体参与下,使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解,形成肉眼可见的空斑。、二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、、200目筛网、SRBC补体(豚鼠血清)、Hank's液、RPMI1640培养液、SA缓冲液(,,,,,加蒸馏水至1000mL、灭菌生理盐水、琼脂糖。:,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,生理盐水2500rpm/min,15min,洗涤3次,制备压积SRBC放入4冰箱保存备用。,30-完全培养基的制备:新生小牛血清经绵羊红细胞(,:、吸收,60min后,加入不完全培养基RPMI1640中,制备成含20%」、牛血清的完全培养基。,静置30-60min,2500rpm/min,15min分离血清,5-10SRBC51v/v4C30-将只豚鼠血清混合后,与压积以:(、比例混合,冰箱放置60min,间或震荡,2500rpm/min,15min分离血清,分装,-80°C冰箱保存。用时以完全:..培养基:10(v/v)比例稀释。%v/v)的细胞悬液(约1108个SRBC,每只鼠腹腔注射。-5天后的小鼠颈椎脱臼处死,无菌取脾脏,并在脾上面放置一块纱布,用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎,制成单个细胞悬液,200目筛网过1000rpm/min10minHank'2RPMI16405X滤,,,去上清,液洗遍,以完全培养基制备成1061X107/mL?个细胞的脾细胞悬液。,加热溶解,待温度于50C1mL/左右时,以孔的量加至六孔培养板中,琼脂凝固后备用。's液中(),加热溶解,以试管46-50C的量加至恒温的试管中。%SRBv/v2001铺板:(生理盐水配制,)、卩脾细胞悬液先后加入含有顶层的试管中,迅速混匀,倒入六孔板中并铺平顶层混合液,每个样本做两个平行孔。%CO21h空斑测定:已制备好培养板放入、培养箱中孵育,然后每孔加入500^1v/v1102h以完全培养基稀释的补体(,:),继续孵育,自动图象分析仪读取溶血空斑图象分析软件计数溶血空斑数。取平行孔空斑数的平均值为样本的溶血空斑数值,以空斑数/106脾细胞表示。,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<,结论:各组均数间差异无显着性;F值》,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。用空斑数/106脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示,受试样品组的空斑数显着高于对照组的空斑数,可判定该项实验结果阳性。血清溶血素的测定可任选下列方法之一。:..用免疫动物后,产生抗SRB(抗体(溶血素),利用其凝集SRBC勺程度来检测溶血素的水平。、生理盐水、微量血凝实验板、,将羊血放入有玻璃珠勺灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4冰箱保存备用,可保存2周。,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min。将压积SRB(用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,每只鼠腹腔注射进行免疫。4?5d后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。,将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内,每孔100卩l,再加入100卩l%(v/v)的SRB(悬液,混匀,装入湿润的平盘内加37C3h盖,于温箱孵育,观察血球凝集程度。,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<,结论:各组均数间差异无显着性;F值》,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。50-W血清凝集程度一般分为级()记录,按下式计算抗体积数,受试样品组的抗体积数显着高于对照组的抗体水平,可判定该项实验结果阳性。抗体水平=(S+2S+3S……nS)式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数,S代表凝集程度的级别,抗体积数越大,表示血清抗体越高。0级红细胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圆点状,四周液体清皙。I级红细胞大部分沉集在孔底成园点状,四周有少量凝集的红细胞。U级凝集的红细胞在孔底形成薄层,中心可以明显见到一个疏松的红点。川级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层中心隐约可见一个小红点。W级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,凝块有时成卷折状。:..注意事项血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。(HC),产生抗SRB(抗体(溶血素),在补体参与下,与SRBC一起孵育,可发生溶血反应,释放血红蛋白,通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。、全自动酶标仪、恒温培养箱、96孔培养板、离心机、恒温水浴、SRBC补体(豚鼠血清)、SA缓冲液(,,,,,加蒸馏水至1000mL、都氏试剂(、高8铁***、***,,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4冰箱保存备用,可保存2周。,分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清),将1mL压积SRBC5mL4C30min70C加入到豚鼠血清中,放冰箱,经常振荡,离心取上清,分装,—保存。用时以SA缓冲液按1:8稀释。,用生理盐水洗涤3次,每次离心2000r/min)10min。将压积SRB(用生理盐水配成2%(v/v、的细胞悬液,每只鼠腹腔注射进行免疫。4?5d后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,使血清充分析出,2000r/min离心10min,或6000r/min,4min,收集血清。(分光光度计测定):取血清用SA缓冲液稀释(一般为200?500倍、。将稀释后的血清1mL置试管内,依次加入10%(v/v)SRBC,补体1mL(用SA液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管SA37C1530min2000r/min(以液代替)。置恒温水浴中保温?后,冰浴终止反应。离心10min。取上清液1mL加都氏试剂3mL同时取10%(v/v)SRBC加都氏试剂至4mL充分混:..匀,放置后,于540nm处以对照管作空白,分别测定各管光密度值。):设样品孔和空白对