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用液-液萃取的溶剂:..2溶剂的用量一般有机相与水相(体内样品)体积比为11~5∶1。3、水相的pH当pH与p相等时,50%的药物以非电离形式存在。a对于碱性药物最佳pH为高于pK1~2个pH单位;对于酸性待测药物,a则要低于pK1~2单位。这样,就可使得90%的药物以非电离形式存在,a而更易溶于有机溶剂中。4、提取操作一般只提取一次。若提取回收率较低(如低于50%)时,可提取2~3次;若干扰物质为脂溶性,不易除去,则可将提取分离出的含药有机相再用一定pH的小体积水溶液反提取后测定,或将反提取液再用有机溶剂提取,如此反复提取可将药物与干扰物质有效分离。液-液提取法的优点在于它的选择性和低廉的运行成本,以及可对样品进行净化和浓集的特点。所以本法在体内药物分析中,尤其是采用LC-MS测定时被广泛应用。三)固相萃取法及其他方法:..们利用色谱理论,采用装有不同填料的小柱进行体内样品的预处理,而发展了固相萃取(,SPE)技术。SPE技术亦称液--固萃取技术,它的应用大大缩短了样品处理时间,同时可避免乳化现象,而且便于自动化操作。solid-phaseextraction,SPE)(1)SPE原理将不同填料作为固定相装入微型小柱,当含有药物的体内样品溶液通过小柱时,由于受到吸附”、“分配”、“离子交换”或其他亲和力作用,药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料)上,用适当溶剂洗除干扰物质,再用适当溶剂洗脱药物。药物的洗脱方式有两种:一种是药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强,因而在用冲洗溶剂洗去干扰物质时药物被保留,然后用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物;②是干扰物质较药物与固定相之间的亲和力更强,则药物被直接洗脱,干扰物质被保留在萃取柱上,使用较多的是前一种洗脱模式。SPE的填料种类繁多,可分成亲脂型(大孔吸附树脂、亲脂性键合硅胶)、亲水型(硅胶、硅藻土、棉纤维)和离子交换型三类,其中亲脂型用得最多。烷基、苯基、***基键合硅胶都可用作固相萃取吸附剂,其中十八烷基硅烷键合硅胶(ODS或C)最常用。亲脂性键合硅胶容18:..质体液中疏水性药物。常见的商品柱有Sep-PakC、Bond-ElutC、1818CN(***基)、C(乙基)、Ph(苯基)Baker10C等。218)SPE操作步骤使用亲脂性键合相硅胶SPE柱的一般操作步骤如下。活化用甲醇润湿小柱,活化填料,以使固相表面易于和待测组分发生分子间相互作用,同时可以除去填料中可能存在的干扰物质。②溶剂交换(平衡)用水或适当的缓冲液冲洗小柱,去除过多的甲醇,但冲洗不宜过分。否则会使甲醇含量过低(低于5%),导致C18链弯曲折叠,对待测物的吸附能力下降,造成萃取回收率降低。③加样使体内样品通过小柱,并弃去滤过废液。④淋洗用水或适当缓冲液冲洗小柱,去除吸附于固定相上的内源性物质或其他相关干扰物质。⑤洗脱选择适当的洗脱溶剂洗脱待测物,收集洗脱液,挥干溶剂备用或直接进行在线分析。使用亲脂性键合硅胶SPE柱时,需注意:①体液样品(如血浆等)通过萃取柱的流速控制在1~2ml/min。②冲洗液和洗脱剂的强度、用量要适当,否则会导致药物的损失或洗脱选择性下降。通常选用可与水混:..萃取碱性药物时,洗脱剂中常需加酸、有机***或氨水、醋酸铵或离子对试剂。对于大量样品的处理,则有赖于半自动化和全自动化的仪器。半自动SPE是指萃取过程机械化,但将洗脱液转移至进样器则需要手工操作。全自动化仪器是通过柱切换技术实现的,利用切换阀使固相萃取小柱直接联入流路中。超滤法(ultrafiltration)是以多孔性半透膜(超滤膜)作为分离介质的一种膜分离技术。通过选用不同孔径的不对称性微孔膜、按照截留分子量的大小,可分离30~1000kD的可溶性生物大分子物质。与通常的分离方法相比,超滤具有不引入化学试剂,没有相态变化,对待测药物的破坏性小等优点。血液中游离药物的测定可采用分子量截留值在5万左右的超滤膜,用加压(2kg/cm2)过滤法或用高速离心法将血浆或血清中游离型药物与分子量大的血浆蛋白以及结合了药物的血浆蛋白分离,从超滤液或离心液中得到游离型药物,然后可直接或经浓缩后测定其浓度。3、缀合物水解药物或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物称为缀合物(conjugate)。内源性物质有葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等,特别是前两种为最重要的内源性物质。一些含羟基、羧基、氨:..物;还有一些含酚羟基、芳***及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。尿中药物多数呈缀合状态。由于缀合物较原形药物具有较大的极性,不易被有机溶剂提取。为了测定尿液中药物总量,需对缀合物进行水解,将缀合物中的药物释出。常用的方法如下:1)酸水解法酸水解时,可加入适量的盐酸溶液。酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件,随药物的不同而异。这些条件应通过实验来确定。该法比较简便、快速,但有些药物在水解过程中会发生分解;与酶水解法相比,其专一性较差。(2)酶水解法对于遇酸及受热不稳定的药物,可以采用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase)或硫酸酯酶(sulfatase)。前者可专一地水解药物的葡萄糖醛酸苷缀合物,后者水解药物的硫酸酯缀合物。实际应用中最常用的是葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶的混合酶。~,37℃培育数小时进行水解。酶水解比酸水解温和,一般不会引起待测物分解,且酶水解专属性强。其缺点是酶水解时间稍长及酶制剂可能带入的黏蛋白导致乳化或色谱柱阻塞。尽管如此,酶水解仍被优先选用。在尿液中采用酶水解,应事先除去尿中能抑制酶活性的阳离子。(3)溶剂解法缀合物(主要是硫酸酯)往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解,称作溶剂解(solvolysis)。例如尿中的甾体硫酸酯在pH1时加醋酸乙酯提取,产生溶剂解,这时的条件也比较温和。:..含量(如采用和RIA法),以获得在体内以缀合物形式存在的量,以及当排出体外时,缀合物占所有排出药物总量的比率,从而为了解药物代谢情况提供更多的信息。某些药物或代谢物极性大、挥发性低或对检测器不够灵敏,使用常规的HPLC或GC难以有效测定,需要先进行衍生化反应,然后测定衍生物。药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化,如含有RCOOH、R–OH、R–NH、R–NH–R′等官能团的药物都可进行衍生化。2体内分析方法的建立与方法验证一、体内分析方法建立的一般程序取待测药物或其特定的活性代谢产物、内标等的标准物质,进行条件试验,通过调整色谱条件,使待测药物与内标物质具有良好的色谱参数及峰面积,并有效避开内源性物质的干扰;同时选择适当的检测器,以获得足够的检测灵敏度。二、体内分析方法的验证体内分析方法验证的内容包含分析方法的效能指标、样品稳定性及提取回收率。分析方法的效能指标包括特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度。:..1、质控样品(qualitycontrolsample,QC)在空白生物介质中加入已知量(高、中、低三水平)待测物标准物质制成的样品,用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批样品分析结果的完整性和正确性。2、标准样品(standardsample)在空白生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的系列浓度的样品,用于建立标准曲线,计算质控(QC)样品和未知样品中待测物的浓度。(一)特异性方法的特异性,又称选择性,用以证明该方法所测定的物质是预期的待测物(原形药物或特定的活性代谢物),而体内内源性物质、降解产物及其他共同使用的药物(伍用药物)不干扰样品的测定。1、内源性物质的干扰分别测定待测药物、活性代谢物的标准物质溶液,及6个不同个体的空白生物介质和QC样品,比较图谱或检测信号,确证内源性物质对分析方法无干扰。对于以软电离质谱为基础的检测方法(LC-MS或LC-MS/MS)应注意考察分析过程中的介质效应,如离子抑制等。2、未知代谢产物的干扰测定QC样品和6个不同个体用药后的实际体内样品,比较图谱或检测信号,确证其他代谢产物对分析方法无干扰。必要时可通过HPLC-DAD和LC-MS(或LC-MS/MS)确证被测定色谱峰的纯度。:..测定待测药物及伍用药物标准物质溶液、QC样品和添加有伍用药物的干扰样品,比较图谱或检测信号,确证伍用药物对分析方法无干扰。(二)标准曲线与定量范围标准曲线(standardcurve),亦称校正曲线(calibrationcurve)或工作曲线(workingcurve),反映了体内分析所测定药物的浓度与仪器响应值(如HPLC峰面积)的关系,一般用回归方程来评价。最常用的回归分析法为最小二乘法(leastsquares)或加权最小二乘法(weightedleastsquares)。标准曲线建立的一般步骤如下:1、系列标准样品的制备取空白生物介质数份,分别加入系列标准溶液适量,制备至少包含6个浓度点的(不包括零点,即空白样品)系列浓度的标准样品(standardsamples)。浓度系列一般为等比梯度模式,通常比例常数约为2,如1、2、5、10、20、50、100。在此系列中,若体内平均达峰浓度为50,其1/,考虑到个体差异,设定最高浓度为100,最低浓度为1,可覆盖全部待测体内样品中的药物浓度。标准溶液”的几何平均浓度,即标准曲线的中间浓度(如系列标准溶液浓度为1、2、5、10、20、50和100时,中间浓度为10)相当。:..取系列标准样品,按拟定方法预处理后分析,以待测药物的检测响应(因变量,)对标准样品中的药物浓度(自变量,x),用最小二乘法或加权最小二乘法进行线性回归分析,求得回归方程(y=a+bx)及其相关系数(),并绘制标准曲线。标准曲线的定量范围要能覆盖全部待测的体内样品浓度范围,定量上限(upperlimitofquantification,ULOQ,标准曲线的最高浓度点)应高于用药后生物介质中药物的峰浓度(C);定量下限max(lowerlimitofquantification,LLOQ,最低浓度)应低于C的10%~5%max(1/10~1/20)。标准曲线回归方程的截距应接近于零,若显著偏离零点,应确证其对方法的准确度无影响;斜率应接近或大于1(与坐标的标度选择有关),使具有较高的灵敏度;相关系数应接近于1,即具有良好的相关性,如色谱法γ。定量下限(LLOQ)是标准曲线上的最低浓度点,表示方法的灵敏度,即测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。测定方法是取同一生物介质,制备至少5个独立的标准样品,其浓度应使信噪比(S/N)大于5,依法进行精密度与准确度验证。在药代动力学与生物利用度研究中,LLOQ应能满足3~5个消除半衰期时体内样品中的药物浓度或C的1/20~1/10的药物浓度的测定。max:..precision)是指在确定的分析条件下相同生物介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度,通常用QC样品的相对标准差()表示。在体内药物分析过程中,无论是药代动力学参数的获得或是治疗药物的监测,通常在1个分析批(analyticalrun)内难以完成全部体内样品的分析。而在不同的分析批之间的实验条件(如仪器性能、参数、试剂来源、实验温度、湿度等)有可能发生小的改变,进而对分析结果可能产生影响。所以在体内药物分析中,方法精密度除要评价批内(within-run或intra-batch)RSD外,同时还应评价批间(between-run或inter-batch)RSD。准确度(accuracy)是指在确定的分析条件下测得的体内样品浓度与真实浓度的接近程度,通常用QC样品的实测浓度与标示浓度的相对回收率(relativerecovery,RR)或相对偏差(relativeerror,RE)表示。1、测定法使用QC样品进行考察,一般选择高、中、低3个浓度的QC样品同时进行方法的精密度和准确度考察。每个QC样品测定1次。在测定批内RSD时,每一浓度至少制备并测定5个样品。为获得批间RSD,应在不同天(一般为3天)连续制备并测定QC样品,至少有连续3个分析批,不少于45个样品的分析结果。2、结果计算与限度要求QC样品浓度用回归方程计算。准确度以多次测定结果的平均值与标准值(制备时的加入量)S比较计算,一般准确度应在范围内,在LLOQ附近应在80%~120%:..或RE的计算式如下。精密度一般要求RSD不超过,在LLOQ附近RSD应不超过20%。(五)样品稳定性1个分析批内的短期稳定性和在整个样品分析期间的长期稳定性。一般包括:生物样本室温放置(一般8h或根据实际情况定)、生物样本于冰箱内(4或20℃)储存反复冻融3次、生物样本长期冰冻至整个分析完成期间的稳定性。另外,还应考察处理后待分析样品进样器放置(一般8-9h)、标准物质储备液(4℃或?20℃放置)的稳定性,以保证检测结果的准确性和重现性。测定法方法是取高、低两个浓度的QC样品,于适当的容器内,在上述规定条件下存放不同时间后测定,每个QC样品重复测定3次,其平均值的偏差应在零时测定值的±5%以内。(六)提取回收率提取回收率(extractionrecovery)系指从生物样本中回收得到待测物的收率,通常以%表示。待测物的提取回收率用于评价样品处理方法将体内样品中待测物从生物介质中提取出来的能力。、中、低三水平的QC样品,每一浓度至少5个样品,依据拟定的分析方法操作,每个样品分析测定1次。另取空白生:..样品同法处理后,加入等量的标准溶液(必要时除去溶剂),同法制备相同的高、中、低3个浓度的标准对照样品,同法测定。将测得的QC样品的信号强度(如HPLC峰面积)与标准对照样品测得的信号强度比较,按下式计算提取回收率:为提取回收率;A为QC样品经制备处理后的信号强度(如HPLC峰面积);A为标准对照样品的信号强度(同A)。ST当采用内标法测定体内样品时,应同时测定内标物质的提取回收率。其测定法同待测药物提取回收率的测定,但仅需制备1个浓度(即体内样品分析时加入的浓度)至少5个QC样品,同法测定、计算。,高、中、低QC样品的提取回收率应一致、精密和可重现。中、高浓度的RSD应不大于15%,低浓度的RSD应不大于20%。(七)分析过程的质量控制在未知样品分析过程中应进行分析方法的质量控制,以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。在分析过程质控中,推荐由独立的人员随行配制不同浓度的QC样品对分析方法进行质量监控。每个QC水平至少双样本,并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批内未:..样品数,使QC样品数大于未知样品总数的5%。