文档介绍：该【RACE技术的原理和操作 】是由【青山代下】上传分享，文档一共【4】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【RACE技术的原理和操作 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。RACE技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展,出现了许多克隆新基因的方法和手段,如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术,主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端,包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善,克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995:Chen,1998:Bespalova等,1998:Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16-30MN-3',M=A/G/C;N=A/G/C/T】,使引物定位在poly(A)尾的起始点,从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5'端加尾时,采用poly(C),而不是poly(A);改进之三是采用RNaseH-莫洛尼氏鼠白血。病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温(60℃-70℃)有效地逆转录mRNA,从而消除了5'含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。随着RACE技术日益完善,目前己有商业化RACE技术产品推出,如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应,结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTTMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5'末端。所以认为,进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMARTTMRACE试剂盒为例,简要概述RACE技术的原理和操作过程。SMARTTM3'-RACE的原理利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)(genespecificprimer,GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作为下游引物,以cDNA第一链为模板,进行PCR循环,把目的基因3'末端的DN***段扩增出来。(见Figure1)'-RACE的原理先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下,,在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个(dC)残基,退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后,转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(见Figure2)。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作为上游引物,用一个基因特异引物2(GSP2genespecificprimer,GSP)作为下游引物,以SMART第一链cDNA为模板,进行PCR循环,把目的基因5'末端的cDN***段扩增出来。最终,从2个有相互重叠序列的3'/5'-RACE产物中获得全长cDNA,或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列,合成相应引物扩增出全长cDNA。,做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此,对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为:第一,在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增),每一步都可能导致失败;第二,扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性,因而特异性一般很低,常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此,使用RACE技术扩增得到的特异末端片段,所获得的重组克隆最好能全够部测序,以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性,最终有可能获得新基因的全序列。随着RACE的不断改进和完善,优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产物克隆技术的迅速发展,RACE必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。RACE的另一种代表方法-Self-(RT)反应。。。'未知区域。***段的切胶回收。。原理见Figure3。:本资料代表个人观点,如有帮助请下载,谢谢您的浏览!整理为word格式