文档介绍：Pfu DNA聚合酶的高保真性和耐热性的生物信息学分析
姓名
学号
学院生命科学学院
专业生命基地班
年级 2011级
2013/12/1
Pfu DNA聚合酶的高保真性和耐热性的
生物信息学分析

Pfu DNA聚合酶,又称Pfu聚合酶或Pfu酶,是在嗜热的焦热球菌中发现的。它是一类能在活体内进行DNA复制的酶。在聚合酶链式反应(PCR)中,使用Pfu聚合酶可以快速的、高保真的扩增DN***段。Pfu酶不仅具有耐热性而且具有高保真性,商业化的Pfu聚合酶试剂,其出错率是100万到130万个碱基对出现一个错配,在PCR反应中,每扩增1kb的DN***%的突变产物,其保真性强于Taq聚合酶,已经渐渐取代了Taq酶在PCR反应中的作用。因此,我想运用生物信息学的方法探究Pfu酶的高保真性和耐热性,以及其相对于Taq酶在PCR技术中的优势。

聚合酶链式反应(PCR) 是一种能在体外快速扩增特定DNA 片段的技术,是在由DNA 模板、引物(一般有上、下游两种引物)、四种dNTP以及适当缓冲液等组成的反应混合物中,在DNA聚合酶的催化下,对一对寡核苷酸引物所界定的DNA 片断进行扩增的反应。在这一反应体系中,DNA 聚合酶起着关键性作用,所以自PCR 技术产生至今,人们一直在通过各种手段努力寻找能够高效特异地催化单核苷酸聚合的DNA 聚合酶。
Taq 酶是第一个被应用于PCR 的高热稳定DNA聚合酶,也是活性最高的一种具有耐热性的DNA 聚合酶,不仅具有5’-3’聚合酶和5’-3’外切酶活性,同时还存在非模板依赖性活性,但缺乏3’-5’外切酶活性,所以在DNA 合成过程中对单
核苷酸错配没有校正功能,每一循环错配率高达2X10-4个核苷酸碱基,不能很好地保证PCR 产物的保真性。并且对于小片段PCR扩增 Taq DNA 聚合酶尚可以,但对于大片段的片段(6kb以上的片段) 就无法完成。近年来利用基因工程方法已经获得了缺少5’-3’外切核酸酶活性和具有3’-5’外切核酸酶活性的Taq 酶,从而拓宽了Taq 酶的应用范围。由于Taq DNA聚合酶的发现,PCR 技术才真正得以推广和应用。
但是人们也在一直不断地寻找酶学性能好、保真度高的PCR 用DNA 聚合酶。因此,继Taq DNA聚合酶之后,人们又陆续发现了Vent1 、Deep 、Pfu、Tgo 和KOD1 等不仅耐热性好且有校正功能的DNA 聚合酶。其中,Pfu DNA 聚合酶是从嗜热的古细菌焦热球菌(us furiosus)中获得,因其超强的纠错功能等特性受到了极大的关注。该酶为2 个蛋白亚基(P45 和P50) 的多聚体,含775 个氨基酸,分子量为90KD。Pfu DNA 聚合酶热稳定性极强,有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切核酸酶活性,所以在催化聚合反应的同时可纠正聚合反应过程中的错误掺入。Pfu 酶的错配率比其它校正酶低2~60 倍,比Taq DNA 聚合酶低6~100倍,因而显示出极高的保真度,所以与其它的聚合酶相比,其PCR产物的错配率大大降低,特别是进行2kb 以内的DNA 片段的扩增, 效果甚佳。

数据库:RCSB PDB数据库、NCBI数据库、Inter Pro数据库等
分析软件:PyMOL三维结构显示软件

利用RCSB PDB数据库获得Pfu基本信息
获得Pfu酶的结构
(1)首先打开PDB数据库的首页并按如下操作:
(2)选取如下条目:
(3)得到如下页面:
(4)得到Pfu聚合酶的结构图
(5)得到pfu聚合酶的结构图:
获得Pfu酶的氨基酸序列
(1)按图进行操作:
(2)按图进行操作下载氨基酸序列:
即得到以下序列:
MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYIYALLRDDSKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPI
TVWKLYLEHPQDVPTLREKVREHPAVVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMI
SYADENEARVITWKNIDLPYVESVSTEKEMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEKLGIKLTIGRDGSEPK
MQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVIRTTINLPTYTLEAVYEAIFGKPKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATY
ELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVK