文档介绍：植物细胞器的分离
一、叶绿体的分离:
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采用差速离心法,利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同,把叶绿体的颗粒沉降出来。
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成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、
细胞器分离缓冲液:300 mmol/L山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(), 5 mmol/L EDTA(pH ), %β-巯基乙醇(临用前加入)。
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SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团)
表1叶绿体分离试剂配置
名称
使用浓度
配制体积
从母液吸取体积
母液浓度
称取g
实际g
母液体积
备注
山梨醇
mol/L
100ml
10ml
3mol/L

100mL
Tris-HCl

100ml
pH
EDTA
mol/L
100ml
1ml

100mL
pH
β-巯基乙醇
%
100ml
100ml
%

100ml
蔗糖
52%
100ml
100ml
52%
52
100ml
蔗糖
30%
100ml
100ml
30%
30
100ml
EDTA
mol/L
100ml
100ml

100mL
pH
EDTA
mol/L
100ml
100ml

100mL
pH
计算过程:
山梨醇:配制体积:100 mL,浓度:3 mol/L;分子量:
需要称取质量g:=100 mL*3 mol/L*=*3 mol/L*=
EDTA: 配置体积:100ml , 浓度: ,分子量:
m= *100mL * = g
LEDTA : 配置体积:100ml 浓度:25mol/L ,分子量:
m=*100mL * =

叶绿体粗提物的制备
(1). 取25 g叶片置于100 mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2 min(5000r/min),
(2). 然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯,
(3). 滤液于4℃、700g在1000r/min离心10 min,
(4).弃去细胞核沉淀上清液再于4℃、2 000 g在3000r/min离心10min,所得沉淀即为叶绿体粗提物,
(5). mL细胞器分离缓冲液中备用。
密度梯度离心制备完整叶绿体
(1).用50 mL离心管制备蔗糖梯度,底部为18 mL含52%(质量分数)的蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl