文档介绍：RNA检测方法研究新进展
张攀松马翠萍石琰璟
青岛科技大学化工学院
X
关注成功!
加关注后您将方便地在我的关注中得到本文献的被引频次变化的通知!
新浪微博
腾讯微博
人人网
开心网
豆瓣网
网易微博
摘    要:
RNA作为某些病毒, 类病毒的遗传物质。在生物体的生长、发育及疾病发生中扮演着重要的角色。同时, 对基因转录, 翻译起着重要的作用。因此, RNA检测是生化分析中重要的一部分。本文主要对RNA的检测方法进行简要的综述。
关键词:
RNA快速检测; DNA聚合酶; 反转录;
作者简介:张攀松(1992—) , 女, 硕士研究生.
基金:国家自然科学基金项目(21375071, 31670868, 21675094)
Research Progress of RNA Detection Methods
ZHANG Pansong MA Cuiping SHI Yanjing
College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology;
Abstract:
RNA is the ic materia in some plays an important role in anism′s growth, development and , it is the the important to gene , RNA detection is an important part of biochemical article mainly discusses the detection of RNA detection method briefly.
Keyword:
RNA detection; DNA polymerases; reverse transcriptase;
RNA, 包括mRNA和miRNA, rRNA, tRNA等。这些RNA都参与了细胞的基因表达, 基因调控, 代谢调控等。有着生命活动的细胞, 会有大量的RNA积累。因此RNA也是活体细胞的一个标志。据统计, 哺乳动物的细胞中RNA的含量大约为10μg, rRNA占80%~85%, (主要可分为28S, 18S, ) , 15%~20%由tRNA和sn RNA等组成。RNA是核糖核苷酸组成的, 核糖核苷酸的基本单位是核苷酸, 是由碱基, 核糖, 磷酸组成的。
1 反转录聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)
反转录PCR又称为逆转录PCR, 是将RNA的反转录过程和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR) 相结合的技术, 是目前应用最广泛的RNA检测方法, 其原理如图1所示。该方法首先需要提取组织或细胞中的总RNA, 以其中的mRNA作为模板, 在反转录酶的作用下采用Oligo (dT) 或随机引物在42℃反应60min反转录为cDNA, 再以cDNA为模板进行PCR扩增。RT-PCR反应可使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级, 使一些极为微量RNA样品分析成为可能, 还可用于检测细胞/组织中基因表达水平和细胞中RNA病毒的含量等, 应用范围十分广泛。由于在聚合酶链式反应中引物之间会发生反应, 即引物和引物之间会发生非特异性反应。SYBR Green I会嵌插在双链中, 从而产生非特异性[1-2]。在检测中会遇到假阳性的问题。这样不利于食品安全, 生物医学等方面的检测。
图1 Schematic description of RT-PCR   下载原图
因此, 为了克服这一缺点, 1996年MORRIS等[3]在PCR反应体系中利用Taq Man探针来检测扩增产物。反应原理如图2所示, MORRIS等利用Taq Man探针荧光检测体系来检测丙型肝炎病毒。首先利用反转录酶将HCV RNA进行反转录, 然后用PCR扩增, 在扩增体系中加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针, 该探针的一段DNA序列是可以与cDNA进行杂交。在探针的5′端和3′端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭基团。根据荧光能量共振转移原理, 探针在与靶标结合的时候, 荧光基团发出的光会被淬灭基团所吸收。当靶标进行扩增时, Taq酶与探针接触, 会利用其5′-3′外切酶活性将荧光基团水解下来。荧光基团会游离在溶液中, 从而发出荧光。使得发出的荧光信号与扩增的产物是成正相关的。利用Taq Man探针来检测靶标, 对于引物形成的二聚体不会影响阳性反应的判断。从而增