文档介绍：中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(6):103?108
产琥珀酸放线杆菌的原生质体制备与再生
毛雨2 王丹1,3 李强1,3 邢建民1黄占斌2
(1中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室北京 100190)
(2中国矿业大学化学与环境工程学院北京 100083 3中国科学院研究生院北京 100049)
摘要基因组重组技术是一项重要的菌种改造技术,原生质体制备和再生是进行基因组重组的
前提和基础。目前少有关于产琥珀酸放线杆菌(inogenes)2650原生质体
研究的报道。为了优化该菌的原生质体制备和再生条件,及利用基因组重组技术构建优良菌种
提供参考,研究了甘氨酸预处理,菌龄,酶浓度,作用时间,温度对产琥珀酸放线杆菌原生质体制
备和再生的影响,并考察了不同渗透压稳定剂对其再生的影响。结果表明,菌体在添加了
TSB培养基中培养 5h后收集,用 SMM稀释到 OD660 =,用
菌酶在 37℃下酶解 45min制备原生质体,将原生质体涂布于含 ,
再生率最大,达到 %。确定了产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的最佳条件,所用的原
生质体制备的方法对琥珀酸的产生没有影响,这为进一步开展该菌的原生质体诱变及基因组重
组等研究奠定了基础。
关键词产琥珀酸放线杆菌琥珀酸原生质体基因组重组
中图分类号 Q9333
琥珀酸是一种广泛存在于各种生物中的有机酸,是 MgCO3 等碱液中和,使发酵体系 pH保持在
生产多种化学产品的中间原料。目前生产琥珀酸主要方间[8]。
法有两种,化学合成法和微生物发酵法,前者以不可再生基因组重组技术(Genomeshuffling)是在 20世纪
的石油为原料,成本高且对环境有较大负面影响,而发酵 90年代由美国加州 Maxgen公司在原生质体融合技术
法生产琥珀酸由于其高效率,环保性以及原料的可持续的基础上提出了一个概念,是经典微生物诱变育种技
性,现已成为琥珀酸生产研究中的一个热点[1]。目前,琥术与原生质体融合技术的有机结合。自此技术诞生以
珀酸工业发酵菌的研究主要集中在产琥珀酸放线杆菌来,短短几年时间里在工业生产菌种改进及开发方面
(inogenes)[23],产琥珀酸曼氏杆菌就获得了成功的应用。2002年,Zhang等[9]成功应用基
(iniciproducens)[4],产琥珀酸厌氧螺菌因组重排技术快速提高了弗氏链霉菌()的泰
(Anaerobiospirillum iniciproducens)[5],和大肠杆菌洛星产量。同年,Patnaik等[10]也通过基因组重排技术
(Escherichiacoli)[6]等。其中产琥珀酸放线杆菌 130Z 提高了乳酸杆菌的耐酸性能。因此,我们期望通过基
(55618)具有能利用多因组重组技术来提高菌株耐酸性是可能的。选育耐酸
种碳源及能耐受高浓度的琥珀酸盐和葡萄糖等优点, 性琥珀酸放线杆菌,可以减少发酵过程中 pH中和剂的
且其琥珀酸产量可达 110g/L[7],是迄今报道的琥珀酸使用,有效地减少杂