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饲料添加剂的固体发酵底物由50质量%蒲公英,45质量%麸皮和5质量%玉米粉以及各自分别为0、%、%、%%的碳酸氢钠、辣椒素和生姜粉组成。包括蒲公英、麸皮、玉米粉在内的固体发酵底物均购于市场,粉碎过40目筛,得到固体发酵底物。发酵菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酿酒酵母(haromycescerevisiae)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)均购自内蒙古自治区草食家畜饲料工程技术研究中心。枯草芽孢杆菌种子液的制备:将甘油保存的枯草芽孢杆菌接种于营养肉汤固体培养基中活化24h后,挑取生长良好的单个菌落,接种于上述营养肉汤培养基中,37℃,120rpm摇床培养24h,即为枯草芽孢杆菌种子液。酿酒酵母种子液的制备:将甘油保存的酿酒酵母接种于麦芽汁固体培养基中活化24h后,挑取生长良好的单个菌落,接种于上述麦芽汁培养基中,28℃,120rpm摇床培养24h,即为酿酒酵母种子液。植物乳杆菌种子液的制备:将甘油保存的植物乳杆菌接种于MRS固体培养基中活化24h后,挑取生长良好的单个菌落,接种于上述MRS液体培养基中,37℃静止培养24h,即为植物乳杆菌种子液。(1)不同菌种比例对发酵蒲公英多糖产量的影响将上述培养获得的枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母种子液和植物乳杆菌种子液分别以1:1:1、4:3:3、3:4:3、3:3:4的比例配制得到混合菌液(在混合菌液中,枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌各自为约5×109CFU/g,下同)。所述混合菌液按10质量%的总接种量分别接种于灭菌后的上述固体发酵底物(50质量%的蒲公英,45质量%的麸皮和5质量%的玉米粉、%的碳酸氢钠、%%的生姜粉)中,加入水至含水量50质量%,于30℃恒温光照培养箱中静置发酵培养72h,发酵结束后45℃烘干,通过测定发酵蒲公英多糖产量来筛选最优菌种比例。:..1:1:±<sup>bc</sup>4:3:±<sup>a</sup>3:4:±<sup>bc</sup>3:3:±<sup>c</sup>±<sup>d</sup>不用菌种比例对发酵蒲公英多糖产量的影响见表1。由表1可以看出,经过固态发酵,蒲公英多糖产量由高到低所对应的菌种比例依次为4:3:3、3:4:3、1:1:1、3:3:4。其中,枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌以4:3:3的比例发酵蒲公英的多糖产量显著高于其他各组(P<),,%,因此选择最佳菌种比例4:3:3。(2)发酵温度对发酵蒲公英多糖产量的影响将枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母种子液和植物乳杆菌种子液以4:3:3的比例按10质量%的总接种量接种于灭菌后的固体发酵底物(50质量%的蒲公英,45质量%的麸皮和5质量%的玉米粉、%的碳酸氢钠、%%的生姜粉)中,加入水至含水量50质量%,用玻璃棒搅拌均匀,分别置于28℃、30℃、32℃、34℃、36℃恒温培养箱中发酵72h,发酵结束后于45℃烘干,通过测定发酵蒲公英多糖产量来筛选最佳发酵温度。发酵温度对发酵蒲公英多糖产量的影响见图1。由图1可知,随着发酵温度的增加,多糖含量:..~34℃时,多糖产量差异不显著,但是发酵温度为34℃时多糖产量最高,。所以,选择34℃为最佳发酵温度。(3)含水量对发酵蒲公英多糖产量的影响将枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母种子液和植物乳杆菌种子液以4:3:3的比例按10质量%的总接种量接种于灭菌后的固体发酵底物(50质量%的蒲公英,45质量%的麸皮和5质量%的玉米粉、%的碳酸氢钠、%%的生姜粉)中,加水至含水量分别达40质量%、45质量%、50质量%、55质量%和60质量%,用玻璃棒搅拌均匀,置于34℃恒温培养箱中发酵72h,发酵结束后发酵结束后于45℃烘干,通过测定发酵蒲公英多糖产量来筛选最佳含水量。含水量对发酵蒲公英多糖产量的影响见图3。由图3可知,蒲公英多糖产量由高到低所对应的含水量依次为50质量%>55质量%>45质量%>60质量%>40质量%。其中,含水量为50质量%时,。因此,选择最佳含水量为50质量%。(4)接种量对发酵蒲公英多糖产量的影响将枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母种子液和植物乳杆菌种子液以4:3:3的比例分别按6质量%、8质量%、10质量%、12质量%、14质量%的总接种量接种于灭菌后的固体发酵底物(50质量%的蒲公英,45质量%的麸皮和5质量%的玉米粉、%的碳酸氢钠、%%的生姜粉)中,含水量50质量%,用玻璃棒搅拌均匀,置于34℃恒温培养箱中发酵72h,发酵结束后于45℃烘干,通过测定多糖产量来筛选最佳接种量。接种量对发酵蒲公英多糖产量的影响见图3。由图3可知,随着菌种接种量的增加,多糖含量先增加后趋于稳定。当接种量为10质量%时,。因此,选择菌种最佳接种量为10质量%。(5)发酵时间对发酵蒲公英多糖产量的影响将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌以4:3:3的比例按10质量%的总接种量接种于灭菌:..质量%的蒲公英,45质量%的麸皮和5质量%的玉米粉、%的碳酸氢钠、%%的生姜粉)中,含水量50质量%,用玻璃棒搅拌均匀,置于34℃恒温培养箱中分别发酵48h、60h、72h、84h和96h,发酵结束后于45℃烘干,通过测定多糖产量来筛选最佳发酵时间。发酵时间对蒲公英多糖产量的影响见图4。由图4可知,多糖产量先增加后降低,发酵48h~72h差异不显著,但是发酵时间为72h时多糖产量最高。因此,以蒲公英50质量%、麸皮45质量%、玉米粉5质量%为固体发酵底物,枯草芽孢杆菌:酿酒酵母:植物乳杆菌4:3:3为发酵菌种,总接种量为10质量%,含水量50质量%,在34℃条件下发酵72h,平行发酵3次,将发酵产物于45℃烘干后与腐植酸钠以2:1的比例进行复配,制备出一种发酵蒲公英饲料添加剂产品。±。实施例2:本技术提供的发酵蒲公英饲料添加剂中活性成分的测定(1)多糖的提取与测定多糖的提取与测定:取产品1g加入20ml蒸馏水中,80℃水浴浸提30min,离心(5000r/min,10min)后取上清液进行多糖产量的测定。多糖的测定采用苯酚-浓硫酸法,由下列公式计算得出:(2)黄酮的提取与测定①黄酮的提取取干燥的饲料添加剂1g加入20ml蒸馏水中,80℃水浴浸提30min,冷却,离心(5000r/min,10min)后取上清液待测。②黄酮的测定:..取样品于试管中,在每个试管中加入5体积%,摇匀,放置6min,加入10体积%,摇匀,放置6min,再加入4体积%的氢氧化钠2ml,摇匀,放置15min,加入蒸馏水滴定到刻度(5ml),在510nm波长下测定吸光度。以芦丁为标准品,制作标准曲线测定多酚的含量。单位为mg/g。(3)多酚的提取与测定①多酚的提取取干燥的饲料添加剂1g加入16ml蒸馏水中,90℃水浴浸提60min,冷却,离心(5000r/min,10min)后取上清液待测。②多酚的测定多酚的测定采用福林酚比色法。,在每个试管中加入10体积%,摇匀,反应3~8min,加入2mL20体积%的碳酸钙溶液,加水至刻度,摇匀。室温下放置60min,在765nm波长下测定吸光度,以没食子酸为标准品,制作标准曲线测定多酚的含量。单位为mg/g。根据实施例1的方法制备发酵蒲公英饲料添加剂,测定发酵蒲公英多糖等活性成分,结果参加下表2。,NaHCO3、。另外,还对发酵之前的固体发酵底物和发酵之后制得的发酵蒲公英饲料添加剂的活性成分进:..。(mg/g)±<sup>b</sup>±<sup>a</sup>黄酮(mg/g)±<sup>b</sup>±<sup>a</sup>多酚(mg/g)±<sup>b</sup>±<sup>a</sup>注:发酵之前的固体发酵底物的组成如下:50质量%的蒲公英,45质量%的麸皮和5质量%的玉米粉、%的碳酸氢钠、%%的生姜粉;发酵蒲公英饲料添加剂为以50质量%的水和实施例1所述的液态复合菌剂以实施例1中相同的方式制得。发酵蒲公英前后的活性成分对比见表3。由表3可以看出,与发酵前底物相比,发酵蒲公英饲料添加剂中的多糖、黄酮、多酚含量显著增加(P<)。其中,%,%,%。实施例3:本技术提供的发酵蒲公英饲料添加剂对肉羊饲喂效果、血液抗氧化指标的影响在配方如表4所示的肉羊基础日粮的基础上分别添加0、、、、。(饲喂基础):..Ca,130g;P,65g;盐,85g;维生素A,140000U;维生素D3,37500U;维生素E,375mg;维生素K3,25mg;维生素B1,25mg;维生素B6,25mg;核黄素,75mg;维生素B12,;尼克酸,300mg;泛酸,200mg;叶酸,15mg;生物素,;铁,1300mg;铜,200mg;锌,1200mg;Mn,1000mg;碘,9mg;硒,7mg;Co,12mg。将体况良好、体重相近(±)的4月龄杜蒙杂交肉羊50只,随机分为5组,每组10只。试验期为75天,其中预饲期15天,正试期60天。结合前期试验基础,对照组正常饲喂基础日粮,不添加抗氧化饲料添加剂,、、、。试验羊自由饮水,每天晨饲前,记录前一天的剩料量,并根据剩料量调整饲喂量以确保10%的剩料,每天饲喂2次(08:00和18:00)。试验在自然通风羊舍内进行,保持舍内清洁,随时观察并记录养只的食欲、精神状况、腹泻等情况。试验期间,按场内的常规免疫程序进行免疫、驱虫。试验开始时,称量初始体重,于试验第60天,早上空腹称重,计算平均日增重;每天记录喂料量和剩料量,采集饲料和剩料样品测定干物质,计算干物质采食量和饲料转化效率。于正试期第60天晨饲前利用真空采血管对试验羊(每组随机选取1只羊)的颈静脉进行采血。测定总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。,每公斤体增重的干物质采食量。a,b同行肩标不同表示差异显著。(P<):..日粮添加不同浓度发酵蒲公英饲料添加剂对杜蒙杂交肉羊生长性能的影响见表5。各处理组肉羊初始体重差异不显著。由表5可知,~。~,但差异不显著。~,~。。由表6可知,与对照组相比,~(T-AOC)显著高于其他各组(P<)。各处理组间母羊血浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平差异不显著(P>)。~。综合以上实施例的结果可以看出,本技术的发酵蒲公英饲料添加剂是一种促进肉羊生长、提高饲料消化率和增强血液抗氧化功能的安全、健康的抗氧化性饲料添加剂产品。最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本技术的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本技术进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例技术方案的精神和范围。