文档介绍：白皮书 Anza碱性磷酸酶
使用Anza碱性磷酸酶的最佳去磷酸化
实验方案
5'
摘要
P 3'
基于20世纪70年代开始发展的重组DNA技术,使用限制酶和 P
5'
连接酶的传统克隆仍然是处理和扩增目的片段和质粒
DNA DNA 3'
的最常用方法。要提升传统克隆的克隆效率,一些DNA修饰酶
已成为克隆实验流程中的重要部分。克隆载体制备中常用的一
使用UseAnza Anza碱性磷酸酶对限制酶酶切载体 Alkaline Phosphatase to
dephosphorylate vector digested with
种DNA修饰酶是碱性磷酸酶,它可以去除DNA和RNA末端的5'- restriction进行去磷酸化 enzymes ,to防止自身连接 prevent self-ligation.。
磷酸基团。Invitrogen™ Anza™碱性磷酸酶(货号:IVGN2208)
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是Invitrogen™Anza™限制酶克隆系统内的全新产品,可与
3'
Invitrogen™ Anza™缓冲液完全兼容,可与所有Anza限制酶结合
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使用。我们在此介绍了三种去磷酸化实验方案中Anza碱性磷酸
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酶的特点,说明其最简单且最高效的使用方法。
简介载体去磷酸化可以减少不含插入片段的转Dephosphorylation of vector lowers the
number of transformants without insert
化子的数量(background), (背景 thereby),从而减少了所需筛选 reducing the
载体制备是克隆成功的关键步骤。质粒DNA的低效酶切或自身 number菌落的数量 of colonies 。to screen.
连接会降低克隆效率,提高空载体的菌落背景。使用带有阳性或
蓝/白斑筛选标志物的载体无需筛选大量菌落,提高了挑取到带图1. 使用碱性磷酸酶将质粒DNA去磷酸化。
有DNA插入片段菌落的可能性。但是,在转化过程中自身连接载
体将与携带插入片段的载体竞争,会减少携带目标插入片段的转
但是,当使用一种或两种限制酶酶切质粒DNA,形成匹配末端(
化子数量。
例如XhoI和SalI酶切中的平末端或突出末端)时,应进行载体DNA
当使用两种限制酶酶切质粒DNA形成不配对的末端时,由于自身的去磷酸化,防止自身连接。去磷酸化通常使用碱性磷酸酶去除
连接的可能性较低且插入片段数量明显多于载体,因此通常无需 DNA 5'端的磷酸基团(图1)。不经去磷酸化处理,相同分子的配
进行载体去磷酸化。连接反应中插入片段:载体的标准摩尔比是对磷酸化末端之间的连接(即自身连接) 相比载体与插入片段之
3:1。间的连接更高效,会导致自身连接质粒DNA的高背景。
我们在此介绍了使用Anza碱性磷酸酶和Anza限制酶建立的三种材料与方法
去磷酸化实验方案。对于酶切后的DNA,最佳的Anza碱性磷酸
实验评估首先使用一步法实验方案针对所有内切酶同时进行
酶实验方案高度依赖于酶切中所使用的Anza限制酶的特性。我
DNA酶切和去磷酸化。对于使用一步法实验方案无法实现完全
们提供了三种去磷