文档介绍：2018/2/25
中山大学药学院张革
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(四)载体DNA与目的基因的连接
DNA分子体外重组:
连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接。形成重组子(binant)的过程。
:
经双酶切获得粘性末端,用连接酶进行连接
:
连接效率低,一般采用加尾法、接头法
:
目的基因与载体DNA的摩尔比大于1
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不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接
Eco RⅠ切割位点
Bg lⅡ切割位点
+
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
Eco RⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
T4 DNA连接酶
15ºC
重组体
配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。
定向克隆
连接反应?
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问题:
如何加入合成接头?
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Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
人工接头及其应用
CCGAATTCG
GGCTTAAGC
5´-
3´-
Eco RⅠ
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cDNA克隆的过程
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(五)重组DNA导入宿主细胞
宿主细胞:
原核细胞:大肠杆菌、枯草杆菌链球菌
真核细胞:酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞
原核细胞的转化方法:
电穿孔转化法
化学转化法
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导入方式:
转化(transformation)
转染(transfection)
感染(infection)
◆转化(transformation):
以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.
◆转染(transfection):
以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程.
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表达产物的形式:细胞内不溶性表达(包含体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达,极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平,且会带来完全不同的杂质。