文档介绍：R带和SCE技术操作要点
田明忠
R带技术-操作流程
0day 常规外周血培养细胞
3rd day 加入BrdU终浓度为10μg/ml,继续培养6h。
3rd day 用1ml注射器加入秋水仙素20μg /ml工作液三滴,继续培养4h;或者加入秋水仙素100μg /ml工作液三滴,继续培养1h 。
3rd day 常规收获细胞,常规制片、烤片等。
R带技术-显带
在60℃恒温水浴箱中,置一培养皿于水面上(皿内加1/3 2×SSC溶液,将所制玻片浸泡在内)。距玻片10cm处放置一20瓦紫外灯,照射玻片30-45分钟(注意玻片细胞面正对紫外灯);
待紫外处理时间结束后,用自来水冲净;
10%Giemsa染色15分钟,自来水冲净,室温干燥后于镜下观察。
秋水仙素处理4h结果
注意细节
秋水仙素作用时间太长,导致染色体凝集严重,很难得到较好分化的条带,上图是秋水仙素100μg /ml工作液三滴,继续培养1h处理的结果。
染色时间 R带染色时间相对比G带要长,才能保证染出清晰的条带。本次试验作用时间是15mins。
SCE技术操作流程
0day 常规培养外周血
1st day 24h后加入Brdu -10μg/ml,继续培养44-48h
3rd day 用1ml注射器加入秋水仙素20μg /ml工作液三滴,继续培养3h
3rd day 常规收获细胞,常规制片、烤片等。
SCE技术-显带
将标本置培养皿中,正面朝上,上覆擦镜纸、滴加适量2×SSC溶液后,置60℃恒温水浴箱温育,同时用30w紫外线杀菌灯(距玻片5cm)照射30分钟,然后用自来水冲洗玻片,常规Giemsa染色10分钟,再用自来水冲洗,室温下干燥或吹风机干燥。
注意细节
Giemsa液的浓度和染色时间要适宜,过浓、过长时间染色均会导致SCE被掩盖。
BrdU是一种强突变剂,可在开始培养时即加入培养基,亦可培养24-26小时后加入,Brdu浓度太高将抑制细胞生长。
本次试验做了Brdu浓度梯度实验, g/ml、5 g/ g/ml以及10 g/ml 与20 g/ml 。结果表明: 10 g/ml 与20 g/ml 组细胞分裂相很少,不能满足实验要求。 g/ml、5 g/ g/ml组中, g/ml组细胞分裂相最多,同时也能出现SCE染带结果。
g/ml BrdU处理的正常人外周血染色体交换图