文档介绍：西南大学
硕士学位论文
颠茄TRI基因的克隆、功能验证及超量表达对颠茄托品烷生物碱
合成的影响
姓名:强玮
申请学位级别:硕士
专业:植物学
指导教师:廖志华;陈敏
20120530
植物的颠茄��已砌���、莨菪�郊乡可灸哪亩蕆�吐�勇��幼绮崤鹆膌如册�颠茄肼基因的克隆、功能验证及超量表达对颠茄托品摘要烷生物碱合成的影响中提取,产量有限,其中颠茄是中国药典规定的唯一佻药源植物��乙┑湮�被����,植物学专业硕士研究生强玮指导教师廖志华教授陈敏教授分支处的控制点酶。在莨菪中,珊基因特异性的仅在根的内皮层和外皮层中强烈表达,曼陀为材料,采用��技术,基于同源性克隆的方法获得了�捌基因全长��,为���,对推断的�捌基因编码氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明,��沼胍驯ǖ�托品烷类生物碱�阻�用植物颠茄的托品酮还原酶�仃���账鹍��龄��研��騝��ǔげ⒔�辛讼晗傅纳������琓��是一类主要提取自茄科植物的小分子含氮化合物,它提供了临床上常用的抗胆碱药物莨菪碱�����他�投�馆屑�������,广泛用于用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等,市场需求十分巨大。由于工业合成成本太过昂贵,目前莨菪碱和东莨菪碱主要从茄科开展代谢工程以提高颠茄中���烤哂惺�种匾5囊庖澹�狙芯坎捎肦��椒ǹ寺×艘�物信息学分析,同时构建了该基因的植物组织表达谱和诱导表达谱;原核表达验证酶活后,构建植物表达载体遗传转化颠茄获得转基因发根,经过液体发酵培养至指数生长末期,检测总托品烷生物碱含量和相应的��突�虮泶锪俊W钪战峁�砻鳎旱咔阎蠥�砌作为一个控制点酶,它的过量表达能够极大的促进代谢流向莨菪碱和东莨菪碱方向流动,从而显著地提高总托品烷生物碱的产量。�龃呋�衅吠7肿由萧驶�幕乖���衅�,是托品烷生物碱合成途径中问罗和三分三��阦��,∞��迷�蝂“�的�栈�蛞彩强寺≈僚嘌�母�橹�1狙芯考匆缘咔迅�包含一段长度为���腃�、��的�疷�和����’�Γ籶��长度为��,终止密码予为�牛黄浔嗦肭�嗦胍欢��个氨基酸残基的蛋白序列��砌��げ馄浞肿�量大小为�.����鹊绲阄�.�。的茄科其它物种的托品酮还原酶氨基酸序列相似性均在�%以上,而且整体上都很保守,说明它们的��从共同的祖先蛋白开始分化发生在相对较近的时问里;来源于茄科植物、十字花科植物、单子叶植物、细菌的�鰏在发育进化树上明显聚为�В�渲蠥�砌与同科不同
以����蟪Ω司�韊��S盏急泶锵低扯訟�苹�蚪�性�吮泶锕δ苎橹ぃ�璴法检测到了反应产物托品的生成,表明本研究克隆获得了颠茄的功能�捌基因。本研究的实验结果证明了在颠茄中过量表达�捌能够促进代谢流流向目的产物并显著进一步超量表达捌,有可能最大限度的开发��揪兜纳�锛詈铣赡芰Γ�嘤�龆�馆屑畛�与曼陀罗和莨菪的�鰏已经被鉴定属于��易逭庖皇率迪辔呛希唤�徊降娜�督峁乖げ夥����竦霉こ叹鶦������瓵�砌,遗传转化颠茄叶片,经检测��、纠���蠛�得到了大幅度的提高,依次为���亿����淼淖����勘瓤站�⒏�哉蘸涂赵胤�含量提高的发根系�、����、��的基因表达水平都显著高于对照和其它转基因发根关键词:颠茄;托品烷类生物碱;托品酮还原酉�稩;茛菪碱;东茛菪碱西南大学硕士学位论文属的植物三分三��那自倒叵底罱��浯问禽馆校槐J亟峁褂蛟げ夥⑾諥��的氨基酸序列中存在典型的短链脱氢酶����������弱�瑀��仞龄,��甤�卣餍越峁褂颍��现,在��盏腘端���枰5腘��结合区域,存在��畔冉岷螻��的保守氨基酸残基���虯�����痹贑端底物托品酮结合区域也发现了两个决定托品酮分子以正确的取向结合在��傅鞍咨系谋J匕被�岵谢鵋���廷���W橹�泶锲缀陀盏急泶�谱分析表明,该基因强烈地在颠茄成熟叶中表达,花苞和须根也有少量表达,其它部位表达微弱,其表达水平强烈地受����、��、�.�挠盏己蚐�囊种疲�芗烈掖家材�起到强烈的诱导效果。��诱导培养��珹��重组蛋白含量达到了细胞总蛋白的�%以上,主要以包含体形式存在,其分子量约为����朐げ獾南喾�6訟�刚重组蛋白包涵体进行纯化并透析复性后,以托品酮为反应底物,在���嬖谙拢�觳釸���刈榈鞍椎拇呋�钚裕��肏��构建携带��栈�虻闹参锔咝П泶镌靥錺���瓵��转化“卸甲”的根癌农杆菌�椎禪基因后成功筛选出�鲎;�蚍⒏�担�直鸾�幸禾迮嘌��┐笈嘌�缓蠹觳馔衅吠樯�物碱���含量和基因表达量。在检测的�鲎;�蚍⒏�抵校��个发根系的总�疉���根对照分别提高了��倍和��倍,莨菪碱的提高幅度平均要高于东莨菪碱;另外�龇⒏��出现了不同程度的基因沉默,��含量显著低于对照。利用实时荧光定量�