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摘要：
本研究运用ISSR技术，对青海地方核桃（Juglans regia L.）进行了单株遗传关系的分析。共收集了20个核桃单株，通过对7对ISSR引物的PCR扩增产物进行电泳分析，得到了349条位点，%。利用UPGMA法对ISSR扩增产物进行聚类分析，得到了青海地方核桃单株间的分化关系，结果表明，这20个核桃单株可以分为3个群体，其中群体I和群体II均有8个单株，群体III有4个单株，芽同一单株不同采摘时期的点样品结果高度一致。因此，ISSR技术可以为青海地方核桃种质资源的遗传多样性保护和利用提供有力的支持。
关键词：ISSR；青海地方核桃；单株遗传关系
Abstract：
In this study, the ISSR technology was used to analyze the single plant genetic relationships of Juglans regia in Qinghai region. A total of 20 walnut single trees were collected, and 349 bands were obtained through the analysis of PCR amplification products of 7 pairs of ISSR primers, of which the proportion of polymorphic bands was %. The UPGMA method was used to cluster the ISSR amplification products, and the differentiation relationship between the 20 walnut single trees was obtained. The results showed that these 20 walnut single trees could be divided into 3 groups, of which Groups I and II each had 8 single trees, and Group III had 4 single trees. The results of the sample points of the same bud in different harvesting periods were highly consistent. Therefore, the ISSR technology can provide strong support for the genetic diversity protection and utilization of Juglans regia germplasm resources in Qinghai region.
Keywords: ISSR; Juglans regia in Qinghai region; single plant genetic relationship
引言：
青海地方核桃（Juglans regia L.）是中国的优良经济林木种类之一，具有很高的经济价值和观赏价值，是西北地区最主要的果树之一。地理条件的不同，促使青海地方核桃在遗传上出现了一定的差异。保护青海地方核桃物种资源，探究其分化程度和遗传规律，具有重要的经济和科学价值。
分子标记是一种基于DNA分子水平的技术手段，包括序列标记和多态性标记，可用于评价物种间或单株之间的遗传关系，从而为保护和利用植物遗传资源提供可靠的技术手段。其中，ISSR技术以其简便、高效、重复性好、多态性高等特点，成为了遗传多样性研究与保护的重要手段之一。
本研究利用ISSR技术，对青海地方核桃的单株遗传关系进行了分析，旨在提供对青海地方核桃保护与利用的科学依据。
材料与方法：
样本收集
本研究收集了青海地区果树繁殖基地的20个核桃单株样本。
DNA提取和ISSR扩增
采用CTAB法提取核桃单株全基因组DNA，%琼脂糖凝胶电泳检测。选取7对ISSR引物进行PCR扩增，引物信息如下表所示：
表1 ISSR引物信息
引物 片段长度范围（bp） 引物序列
ISSR1 130-900 AGAGAGAGAGAGAGAGTT
ISSR2 150-1000 ATATATATATATATATTC
ISSR3 200-1200 GTGTGTGTGTGTGTGTCA
ISSR4 200-1000 ACACACACACACACACTG
ISSR5 200-1500 TATATATATATATATCTC
ISSR6 300-1200 AAGAGAGAGAGAGAGAGA
ISSR7 500-2000 CTCCTCCTCCTCCTCCTC
PCR扩增反应体系总量25 μL，含反应液、DNA模板、引物、Mg2+、dNTPs和Taq酶。PCR反应程序为：预变性（94℃，5 min）、变性（94℃，40 s）、退火（54-58℃，1 min）、延伸（72℃，1 min）、终伸（72℃，10 min）、4℃保存。每个样本扩增三遍，合并PCR产物后进行电泳分析。
电泳分析
%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳条件为：电压100 V，电流400 mA，电泳30 min。用基因泡沫（Genie DNA Gel Extraction Kit）提取凝胶中的扩增产物，然后利用2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离和检测，并用低分子量DNA标记（DL2000）进行检测。
数据分析
采用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）法对ISSR扩增产物进行聚类分析，计算每个样本的相似系数，建立相似系数矩阵。然后，根据相似系数矩阵进行聚类分析，并画出聚类树。
结果：
ISSR扩增产物及多态性分析
通过对20个核桃单株利用7对ISSR引物进行PCR扩增，共得到349条扩增产物，其中146条是多态性产物，%。如图1所示，ISSR扩增产物长度范围在150-2000 bp之间，长度多集中在500-1000 bp之间，表明ISSR技术可以在相对较广的长度范围内扩增核桃基因的多态片段。
图1 ISSR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图案
单株遗传关系的聚类分析
将20个核桃单株的ISSR扩增产物的二进制数据进行了UPGMA聚类分析，其分化关系如图2所示。聚类树上分为了3个明显的群体，其中群体I和群体II均有8个单株，群体III有4个单株。从图2上看，相似度较高的单株可以划分在同一群体中，相似度较低的则划分在不同群体中。此外，在不同期数的芽的同一单株不同采摘时期的点样品结果高度一致，表明ISSR技术的可重复性和有效性。
图2 单株遗传关系聚类树
讨论：
本研究运用ISSR技术对青海地方核桃的单株遗传关系进行了分析，结果显示：ISSR扩增产物多态性高、重复性好、遗传多样性丰富，可以为青海地区核桃种质资源的遗传多样性保护和利用提供有力的支持。UPGMA聚类分析结果表明，青海地方核桃单株之间存在明显的分化关系，可分为3个群体，不同群体的单株之间具有较高的差异性和分化性，说明青海地方核桃存在一定的遗传多样性，并且具有一定的遗传变异潜力。
结论：
本研究利用ISSR技术对青海地方核桃进行了单株遗传关系的分析，共分析了20个核桃单株样本。通过UPGMA聚类分析，结果显示青海地方核桃单株存在明显的分化关系，可分为3个群体，不同群体之间具有较高的差异性和分化性。这为青海地区核桃种质资源的遗传多样性保护和利用提供了重要的科学依据。