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ICS
GXX
中华人民共和国国家标准
GB/T XXXXX—XXXX
转基因植物品系定量检测数字 PCR 法
QuantitativeDetermination of genetically modified plants by digital PCR method
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（征求意见稿）
（本稿完成日期：2018 年 09 月 26 日）
XXXX-XX-XX 发布 XXXX-XX-XX 实施
: .
GB/T XXXXX—XXXX
转基因植物品系定量检测数字 PCR 法
1 范围
本标准规定了转基因植物品系的数字PCR定量检测方法。
本标准适用于食品、饲料、种子及环境材料中转基因玉米MON810品系、MON89034品系、MIR162
品系和转基因大豆GTS-40-3-2品系，转基因水稻克螟稻品系，转基因棉花GHB119品系，转基因油菜RT73
品系的数字PCR法定量检测及定性 PCR检测结果的确证检测。
本方法的定量检测限为 %（质量分数）。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。
GB/T 转基因产品检测通用要求和定义
GB/T 转基因产品检测核酸提取纯化方法
GB/T 转基因产品检测核酸定量PCR检测方法。
GB/T 转基因产品检测 抽样和制样方法
SN/T 4853（所有部分）转基因大米定量检测 数字PCR法
3 原理
数字PCR技术是将实时荧光定量PCR体系等量均分到相互隔离的大数量（大于10000个）微小的反
应单元（芯片微孔或者微滴液珠），经过PCR扩增 反应，反应单元 相应的表现为有荧光(阳性)或无荧光
（阴性），通过统计微反应单元的阳性率和泊松分布概率函数计算出核酸模板的拷贝数。数字PCR的技
术特点是，不需要建立工作曲线，具有相对较高的准确度，是一种潜在的绝对定量方法。
为了实现转基因植物品系数字PCR定量检测，本标准在反应体系中加入两套标记不同荧光信号的引
物探针，分别用于扩增被检测样品DNA中转基因成分和植物内源基因成分。通过统计数字PCR扩增反
应后两种 荧光信号的阳性率，计算出转基因植物外源基因（品系特异序列）和植物内源基因的拷贝数含
量。依据样品DNA溶液中的外源基因和内源基因的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因植物品系
含量。
4 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
品系特异 序列 Event specific sequence
包括转基因植物侧翼序列和外源插入序列。针对该序列进行检测，可以确定植物 品系的存在。
Adh-1（alcohol dehydrogenase 1）：玉米 乙醇脱氢酶基因，常作为玉米的内源基因。
1 : .
GB/T XXXXX—XXXX
Lectin-1：大豆凝集素基因，常作为大豆的内源基因 。
PEP：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，常作为油菜的内源参照基因，。
Adhc：Alcohol dehydrogenase C gene，乙醇脱氢酶 C 基因，常作为棉花的内源基因。
BHQ1：Black hole quencher 1，黑洞猝灭基团 1。
5 试剂和材料
除另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯，水 为GB/T 6682规定的一级水。
植物基因组 DNA 提取试剂盒。
数字 PCR 预混液：含有镁离子、dNTPs 和具有 5′-3′外切活性的热启动 Taq DNA 聚合酶的数
字 PCR 专用预混试剂。
引物及探针：检测不同植物 品系的引物探针序列具体信息见表1。
数字 PCR 微反应体系生成联排管或芯片。
96 孔荧光定量 PCR 反应板和封膜。
mL 和 mL 离心管。
移液枪头，量程 µL~10 µL；量程 10 µL~100 µL；量程 100 µL~1000 µL。
表 1. 转基因植物外源基因及内源基因的引物和探针序列
基因 名称 序列
上游引物 GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGA
玉米 MON810
下游引物 GGATGCACTCGTTGATGTTTG
品系特异序列
探针 FAM-AGATACCAAGCGGCCATGGACAACAA-BHQ1
玉米 上游引物 TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT
MON89034 下游引物 CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA
品系特异序列 探针 FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGB
上游引物 CACCTTCAGCAACCCGAACTA
玉米 MIR162 品
下游引物 GCTTAGCCTCCACGATCATCTT
系特异序列
探针 FAM-GTCCTCGTCGCTGCCCTTCACCT-BHQ1
上游引物 CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC
玉米内源 基因
下游引物 CCACTCCGAGACCCTCAGTC
Adh-1
探针 VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1
大豆 上游引物 TAGCATCTACATATAGCTTC
GTS-40-3-2 品 下游引物 GACCAGGCCATTCGCCTCA
系特异序列 探针 FAM-ACAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGA-BHQ1
上游引物 GCCCTCTACTCCACCCCCA
大豆内源 基因
下游引物 GCCCATCTGCAAGCCTTTTT
Lectin-1
探针 VIC-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1
水稻克螟稻特 上游引物 TCCGCAATGTGTATTAAGTTGTCTAA
异序列 下游引物 CCGATATGCCTGCCCATCT
探针 FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCCG-BHQ1
水稻内源 基因 上游引物 TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT
2 : .
GB/T XXXXX—XXXX
rice 下游引物 CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC
探针 VIC-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1
上游引物 CCATATTGACCATCATACTCATTGCT
油菜 RT73 品系
下游引物 GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA
特异序列
探针 FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-BHQ1
上游引物 CCCTTGTGAAGCTCGACATC
油菜内源基因
下游引物 CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT
PEP
探针 FAM-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-BHQ1
上游引物 CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA
棉花GHB119品
下游引物 GAAATTGCGTGACTCAAATTCC
系特异序列
探针 FAM-CCTGCAGGTCGACGGCCGAGTAC -BHQ1
上游引物 CACATGACTTAGCCCATCTTTGC
棉花内源基因
下游引物 CCCACCCTTTTTTGGTTTAGC
Adhc
探针 FAM-TGCAGGTTTTGGTGCCACTGTGAATG-BHQ1
6 仪器与设备
实验室常规设备及下列各项：
数字 PCR 系统：包括 PCR 仪、微反应体系发生器或其它具有同样功能的仪器、微反应体系
荧光检测仪或其它具有同样功能的仪器。
分析天平：感量 mg。
生物安全柜。
核酸定量仪。
涡旋震荡仪。
移液枪： µL~ µL;量程 µL~10 µL；量程10 µL~100 µL；量程100 µL~1000 µL。
7 操作步骤
抽样
按照 GB/T 和 GB/T 的规定执行。
制样
按照 GB/T 和 GB/T 的规定执行。
DNA 模板制备
按照 GB/T 和 GB/T 的方法或采用具有相同效果的植物基因组DNA 提取试剂盒进
行 DNA 提取。
DNA 模板浓度控制
按照 SN/T 4853 的规定，为了满足泊松分布要求，数字 PCR 体系中的模板数应不高于微反应体系
数的 5 倍。为保证定量结果的准确性，体系中总模板数应不低于400 个拷贝。
3 : .
GB/T XXXXX—XXXX
数字 PCR 扩增方法
每个试样数字 PCR 反应设置 3 个平行。
数字 PCR 反应体系
双重数字 PCR反应体系见表 2，适用于转基因玉米MON810品系、MON89034品系、MIR162品系和转基
因大豆GTS-40-3-2品系，转基因水稻克螟稻品系。单重数字PCR反应体系见表3，适用于转基因棉花GHB119
品系，转基因油菜RT73品系 。
表 2 双重数字 PCR 反应体系注1
PCR 反应试剂 终浓度
内源基因上游引物(10 µmol/L) µmol/L
内源基因下游引物(10 µmol/L) µmol/L
内源基因探针(5 µmol/L) µmol/L
外源基因上游引物(10 µmol/L) µmol/L
外源基因下游引物(10 µmol/L) µmol/L
外源基因探针(5 µmol/L) µmol/L
注2
2数字 PCR 预混液 1
DNA 模板 /
ddH2O(无菌水) /
表3单重数字PCR反应体系
试剂 终浓度
2×数字 PCR 预混液注1