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主讲教师和试验员：张运峰
一 试验目的
学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和措施
检测碱裂解法提取质粒的成果
检测双酶切法鉴定重组质粒的成果（后续试验）
检测PCR法鉴定质粒的成果（后续试验）
二 试验原理
（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不一样的DNA或RNA分子。
（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其辨别能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
线型DNA分子的分离范围(Kb)
5～60
1～20
～10
～7
～6
～3
～2
配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其辨别能力就越强。
（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。
表1 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分子大小的关系
三 仪器、材料与试剂
、酶切样品和PCR样品。
(凝胶成像系统)等。
、 1XTAE电泳缓冲液、Goldview、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量原则（Marker ）等。
DYY-6C型  双稳定期电泳仪电源（北京六一） 输出范围（显示辨别率）：6-600V(1V)     4-400mA (1mA)    240W
美电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell
一种已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。
缓冲液
缓冲容量
迁移速度
分辨率
用途
TAE
最低
最快
(高10％)
高分子量高
高度复杂DNA混合物；超螺旋DNA
TBE
很高
较慢
低分子量高
价格昂贵，不常用
TPE
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400构成上样缓冲液。作用：
①增长样品比重，以保证DNA均匀沉入加样孔内。
②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。
③使样品呈色，使加样操作更以便。
名称
优点
缺点
EB
（溴化乙锭）
染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。
EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。
Gldview
低毒，灵敏度较高的染料；可以加入样品中。dsDNA呈现绿色荧光,而ssDNA呈红色荧光,能较好地区分dsDNA与ssDNA。
价格稍高，灵敏度 较低。背景强烈。
SYBR
新型低毒，高灵敏度染料，可以加入样品中。
价格昂贵。对小于50 bp染色缺失，小于100的染色效果较差。稳定性差
Genefinder
花青类染料,毒性很低；最大吸收峰为 470nm。具有安全、灵敏、经济的特点
重复性较差。能引起有机体突变。