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试验目的
学习PAGE分离蛋白质的原理
学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
掌握垂直板电泳的操作措施。
运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
一. PAGE分离蛋白质的原理
PAGE根据其有无浓缩效应，分为持续系统和不持续系统两大类，持续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相似，带电颗粒在电场作用下，重要靠电荷和分子筛效应。不持续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不持续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及辨别率均较前者佳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳--PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis)
以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳措施。
由于其辨别率高，不仅能分离具有多种大分子混合物，并且可以硕士物大分子的特性；如电荷、分子量、等电点及分子构型。
聚丙烯酰胺凝胶的合成
丙稀酰胺
聚丙烯酰胺凝胶
催化剂
聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶的三维网状构造
稀溶液
浓溶液－ －交联剂
凝胶－ －结点
T= X100%
a+b
m
C= x100
b
a+b
C=-
配制凝胶浓度计算及经验公式
凝胶浓度的计算
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是：
上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。
）
聚丙烯酰胺的聚合及影响原因
① 化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。
丙稀酰胺由过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自由基引起单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH 时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率减慢。
在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且反复性差，在 25 ℃聚合的凝胶则较透明和有弹性。
分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵（AP）分解。故在做胶后常要用水进行封闭；
金属离子也干扰凝胶的化学聚合。
②光聚合：以核黄素为催化剂在少许的氧存在下,分解成无色的还原型，在少许的O2条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。
用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；故常用于样品胶的聚合；
聚合的时间可以自由控制
缺陷：光照的量不容易掌握，重现性不太好；
光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合多种凝胶的聚合。
核黄素B1 还原型 游离基 聚合反应
光照
O2
聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应
凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩散减到最小，并且能影响大分子颗粒的移动过程。
大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状原因的影响．
凝胶的这种用于分离不一样尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Size sieving capacity），故将此现象称为分子筛效应（Molecular sieving effect）.
有效孔径取决于凝胶的总浓度 T％，孔径伴随 T% 的增长而减小。
甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，有效孔径最小；T= 5%时，甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，孔径为20nm。
T是凝胶溶质的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分浓度。故T是决定C，分离物的分子量的大小又决定了T的浓度。