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方法概括
原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽
粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法
细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳
动物原料：动物组织或脏器（活体取出） 充分脱血 -10℃ — -50℃保存
植物原料：植物原料 磨碎 加入缓冲液抽提
植物原料特点：1）纤维含量高 2）酚酶活力高 3）缓冲液pH易被细胞内物质改变
微生物原料：菌体培养 做酶活—时间曲线 确定最大酶活时间
第一节 原料选择及预处理
微生物细胞破碎一般采用
化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻复融
物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡
机械法：加磨料；研磨；挤压
缓冲液抽提
抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加5mM的Vc
细胞破碎
第二节 酶的粗提
沉淀
核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉 （b）加入核酸酶将其降解
杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异
选择性沉淀（盐析）：最常用的方法
此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩
硫铵饱和溶液pH<7，若目的酶易酸变性必须用缓冲液
蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关
讨论：
硫铵溶液密度较高（），故需较大离心力
硫铵浓度表示法；饱和度25℃
盐的加入速度合适
沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力
1
透析袋处理：
2
透析袋 EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取
3
透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透析液；监测电导值
4
Sephadex G25 除盐：柱长50cm；上样小于床体积的20%
5
浓缩：a）火棉胶 b）聚乙二醇（PEG）
6
超滤（3-5kg/cm2） d）冻干
透析与浓缩
透析技术原理图
超滤技术原理图
层析技术（chromatography）
第三节 酶的精制
一、层析技术（chromatography）
1）分配层析：物质在两相中的分配系数不同
a）纸层 b）薄层(比纸层灵敏100倍但剥板困难)
c）柱层
2）吸附层析（absorption chromatography）：吸附剂对通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏水作用、范德华力和氢键
a）薄层 b）柱层
填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基磷灰石；常用羟基磷灰石;带正电, -10, 吸附量1mg/g湿剂