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叶苹苹
间接免疫荧光试验专家讲座
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一、原理
依据抗原抗体反应原理，先将已知抗原或抗体标识上荧光素制成荧光标识物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检验细胞或组织内对应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光照射而发出明亮荧光（黄绿色或桔红色），能够看见荧光所在细胞或组织，从而确定抗原或抗体性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
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二、常见荧光素特征
1)FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮黄绿色荧光。
2)RB200：橘红色粉末，吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
3)TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。
4）镧系：Eu、Tb
5)PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。
6）其它：酶作用后产生荧光物质。
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三、分类
直接免疫荧光法
间接免疫荧光法
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四、应用
将病毒接到敏感细胞上进行增殖复制，待病价最高时候进行间接荧光免疫试验
用于分毒时，确定有没有病毒存在
测抗体
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五、优缺点及注意事项
优点：特异性高、敏感性高、速度快
缺点：非特异性染色
注意事项：
1、每次试验应设阳性和阴性对照
2、应注意荧光抗体质量
3、标本应避光保留
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六、操作步骤
1、病毒吸附：5%cpv同时接毒，3d
2、丙酮固定：80%丙酮，4 ℃,1h
3、洗涤：用 PBS 洗涤3遍 ∕ 3min
4、加入一抗：加入抗 CPV 阳性血清（1：100倍稀释），200μL/孔，37℃湿盒中作用 3h
5、洗涤
6、加入二抗：加入 FITC 标识羊抗鼠 IgG 二抗（1:300倍稀释）50μL，37℃闭光作用 1h；
7、洗涤
8、镜检：荧光显微镜观察，拍照，有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。
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七、图示
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